三七皂苷对运动性低血色素大鼠氧化应激的影响*

张 鹤，周 阳，杨月琴，金 丽

(1.武汉体育学院 健康科学学院， 湖北 武汉 4300792；2.解放军150医院 全军军事训练医学研究所，河南 洛阳 4710313)

运动性低血红蛋白被认为是运动员在长期运动性疲劳过程中出现的一种运动性损伤。Weight LM等对长跑和芭蕾舞运动员的研究表明11.7%的长跑运动员和20%的芭蕾舞运动员的Hb浓度低于正常水平[1]，运动性低血红蛋白的发生严重影响运动员成绩与潜能的发挥。三七作为我国传统中药材，其来源丰富，相关药理学证明三七总皂苷(PNS)在耐缺氧、抗衰老、提高机体免疫力等方面的药理作用显著，有研究表明三七皂苷不仅能够促进红系造血，而且在防止机体氧化应激方面有良好的效果[3]。本文将从机体氧化环境的影响来综合分析运动性低血色素的成因，并利用三七皂苷来防治运动性低血红素并评价其对各个过程的影响，为防治运动性低血红素提供参考。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物与分组

选取雄性4周龄的SD大鼠24只，体重如表1，由同济医学院动物实验中心提供，动物级别：SPF级。随机分为3组：对照组(8只)、递增负荷力竭跑台运动组(简称运动组，8只)、递增负荷力竭跑台运动灌药组(简称灌药组，8只)。动物饲料为国家标准啮齿类动物混合饲料，由湖北省疾病控制中心动物实验中心提供。动物饲养环境温度23±2℃；分笼饲养，每笼4只，自由饮食，自然昼夜节律变化光照。具体情况见表1。

表1

组别 n体重(g) 对照组 8 154.88±28.34 运动组 8 169.14±37.84 灌药组 8 172.36±27.91

1.2 实验动物运动方案

所有大鼠先进行1周的适应性饲养，运动组大鼠进行递增负荷跑台训练10周，动物跑台坡度为0°，跑速为30 m/min，第一次训练时间为1min，以后每次递增2min，每周训练6天，前2周每天进行一次训练，其余时间为每天早晚各1次，周一休息。灌药组训练计划与运动组一样，于第六周开始每天灌药一次，药量为11 mg/kgw。对照组不运动，自由饲养10周。为了排除灌药行为对SD大鼠的影响，运动组与对照组从第六周起都灌相对剂量的生理盐水。训练过程中判断大鼠力竭的标准为：连续施加机械刺激大鼠不能继续跑动且下跑台后腹部触地严重呈“甲鱼状”，则可以允许其休息2-5min。

1.3 样本采集

训练开始前和训练结束后对各组大鼠进行断尾采血用于常规血液指标的测定。训练结束后用不抗凝负压管心尖采血取大鼠心血4-5 ml，静置1 h，之后用离心机4 000 rpm离心10 min，得到的血清转移至EP管中。

1.4 指标的测定

全血指标的测定：用sysmexF-820全血细胞分析仪测定断尾血样的血红蛋白(Hb)和红细胞数目(RBC)等指标。

血清样本中SOD、MDA的测定：用黄嘌呤氧化酶法测定SOD的活力(波长于550nm处，1cm光径比色杯)，用硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA浓度(波长于532nm处，1cm光径)；均采用南京建成生物工程公司试剂盒测定，并按试剂盒的操作程序进行测定。

1.5 数据统计学处理方法

实验数据采用SPSS13.0统计学软件进行分析，实验数据均以平均数±标准差表示，组间显著性差异比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两组间比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体重、体征和行为的变化

运动组大鼠经过10周递增负荷力竭跑台运动后，其体重与对照组相比低11.31%，有显著性差异(P<0.05)。该组大鼠的皮毛明显失去光泽，脱毛现象严重，毛发脱落成稀疏状，眼神变得黯淡无光，进食明显减少。而后两周多数大鼠训练过程中极易出现严重疲惫的特征：腹部触地或严重地呈“甲鱼状”，呼吸急促，运动协调能力明显下降，逃避反映减少或消失，探索行为减少或消失，持续运动时间减少。灌药组大鼠体重虽然较对照组没有显著性差异，但是较运动组高6.2%。

表2 10周递增负荷运动对各组大鼠体重的影响

组别 n体重(g) 对照组 8 345±35.23 运动组 8 306±22.24** 灌药组 8 325±38.98

注：与对照组相比，**P<0.05。

2.2 十周递增负荷力竭跑台运动后各组大鼠血液指标

运动组Hb较对照组Hb低24.2%，但无统计学意义；灌药组Hb较运动组提高了9.5%，但无显著性差异。运动组RBC较对照组RBC低17.3%，但无统计学意义；灌药组RBC较运动组提高了0.8%，但无显著性差异。

表3 10周递增负荷运动对血液指标的影响

组别 nHb(g/dL) RBC(106/μL) 对照组 8 16.55±0.44 9.02±0.71 运动组 8 12.53±1.74 7.46±0.73 灌药组 8 13.72±0.80 7.52±0.92

2.3 十周递增负荷跑台运动后各组大鼠SOD、MDA的结果

十周递增负荷运动后大鼠运动组SOD较对照组低5.6%，但无统计学意义，灌药组SOD较运动组提高了25.3%，但无统计学意义；运动组MDA较对照组显著性升高(P<0.05)，灌药组MDA较运动组显著性降低(P<0.05)。

表4 10周递增负荷运动对SOD、MDA的影响

组别 n SOD(U/ml) MDA(nmol/ml) 对照组 8 30.74±18.64 3.24±0.20 运动组 8 29.02±19.70 5.16±0.89* 灌药组 8 36.37±15.93 3.80±2.02**

注：与对照组相比，*P<0.01，与运动组相比，**P<0.05。

3 分析与讨论

3.1 三七皂苷对运动性低血色素大鼠红细胞相关参数的影响

研究发现在大强度大负荷的训练期间，运动员血红蛋白浓度容易发生10%以上的降低，形成了一种相对的贫血状态，其称之为运动性低血红蛋白[4, 5]。本研究结果显示经过递增负荷跑台运动后Hb、RBC较对照组虽没显著性下降，但是Hb较对照组下降了24.2%>10%，符合了运动性低血红蛋白的条件。而灌药组Hb、RBC虽相对于运动组没有显著性差异，但是也是有相对改善，可能与药量不足有关。赵宗翼等对云南竞走队的6名高水平运动员，进行常规的系统训练，每日早晚服用三七维康胶囊，1粒/次(330mg/粒)，每人每日剂量约600mg左右。试验12周，并测4次清晨空腹静脉血,进行血细胞分析。结果显示红细胞、血球压积、红细胞平均体积和红细胞平均体积分布宽度指标经过6周服药后均有所提高，且在12周的测试中4项均具差异有统计学意义。研究认为三七维康胶囊可以提高竞走运动员红细胞及衍生指标、血红蛋白指标、白细胞指标水平，一定程度上可以提高其运氧能力和抗疲劳功效[6]。由此可见三七皂苷对各种原因引起的血色素降低，均有一定的疗效，但是根据引起血色素降低的原因不同，使用剂量和方法也有所差别。

3.2 三七皂苷对运动性低血色素大鼠氧化应激的影响

运动中或运动后机体的耗氧量增加，或者特定通路的激活，是活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生的主要来源[7～9]。有大量研究表明，不适应的运动和剧烈运动可引起氧自由基与抗氧化系统之间的失衡，偏向ROS的生成[10,11]。实验结果表明经10周递增负荷运动后运动组大鼠SOD较对照组低5.6%，MDA较对照组显著性升高，说明了机体组织细胞内的氧化-抗氧化系统失衡，ROS大量产生并对机体产生一系列不利的影响。一方面机体内产生的ROS通过破坏成熟红细胞的细胞膜使其发生裂解，导致红细胞破坏加剧。另一方面又通过多种途径导致红细胞生成减少。首先研究表明过度训练产生的过量ROS引起线粒体上的通透性转换孔打开[12]，这时低分子量的分子(<1.5kDa)顺着浓度差进入到线粒体内部，导致线粒体肿胀和外膜破裂，从而导致细胞凋亡。因此可以得知ROS可通过激活线粒体介导的细胞凋亡途径导致红系造血过程中的前体细胞死亡，造成红细胞生成减少。另一方面有研究表明ROS能够激活血红素抑制激酶(HRI)[13]，HRI能够使真核细胞转录起始因子2的ɑ亚基(elF2ɑ)磷酸化[14, 15]，从而限制血红蛋白的合成。

通过elF2ɑ磷酸化阻碍血红蛋白翻译起始阶段的分子学机制已被广泛的研究[17,18]，elF2是一种三聚体蛋白，在其γ亚基上有GTP/GDP结合位点。被激活的elF2-GTP与起始甲硫氨酰基tRNA和40S核糖体亚基结合形成43S前起始复合物。紧接着其又与60S核糖体亚基结合，绑定在elF2上的GTP水解为GDP，释放的能量用于80S起始核糖体的合成。为了回收elF2在用于下一个起始过程，就需要将其绑定结合的GDP转化为GTP。这个过程需要另一个起始因子elF2B，其在细胞内的量十分有限。当elF2ɑ亚基上51位上的丝氨酸被HIR磷酸化后，它将和elF2B紧密结合并使其失活。当活化的elF2B发生缺乏时，elF-2将会维持在失活的GDP状态并阻碍血红蛋白的合成。因此ROS通过对HRI的激活导致elF2ɑ的磷酸化来抑制血红蛋白的合成进而阻碍红系分化增殖过程。因此总的来说，由于过度训练导致ROS的增加不仅可以导致红细胞的破坏加剧而且使红系造血过程受到抑制，可能是造成运动性低血红蛋白的主要因素。

人参皂苷Re作为PNS的单体之一，潘华山等人通过研究表明人参皂苷Re能降低运动性疲劳模型大鼠血清、肝和骨骼肌MDA含量,提高红细胞、肝和骨骼肌SOD活性,从而达到抗疲劳的作用[19]。三七单体皂苷G-Rb1可以增加人红细胞膜蛋白α螺旋的比例，即增加膜蛋白的有序性，从而改善红细胞膜功能[20]。在本次实验中，灌药组SOD较运动组提高了25.3%，灌药组MDA较运动组显著性降低，表明三七皂苷能够明显改善机体的氧化环境，防止红细胞膜的裂解从而保护红细胞。另外，三七皂苷也可能通过减少机体的ROS水平进而抑制血红素抑制激酶(HRI)的产生，从而使减少elF2ɑ的磷酸化从而促进血红蛋白的合成，进而促进红系造血。

4 小结

三七皂苷具有降低体内氧自由基水平，改善机体氧化环境，降低低氧机制的阈值，增强机体的抗低氧能力，增强机体的适应性，从而改善大鼠运动性低血色素症状。

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