巴西橡胶树HbUBC14基因克隆、生物信息学及表达分析

2014-08-12李德军邓治刘向红刘辉

热带农业科学 2014年5期

李德军　邓治　刘向红　刘辉

摘要从巴西橡胶树中鉴定出一个泛素结合酶（UBC）基因，该基因长653 bp，最长开放阅读框504 bp，预测编码蛋白包含167个氨基酸；序列比对分析发现，该基因编码的蛋白具有一段保守的UBC结构域，与拟南芥E2成员UBC14（At3g55380）具有较高的相似性，故将该基因命名为HbUBC14。半定量RT-PCR分析结果表明，HbUBC14在巴西橡胶树胶乳中表达最高，在花药中表达最低。与健康橡胶树相比，死皮树胶乳中HbUBC14表达量明显下降。HbUBC14表达还受乙烯和茉莉酸调控。以上结果表明，HbUBC14可能在巴西橡胶树死皮、乙烯和茉莉酸反应中发挥作用。

关键词巴西橡胶树；HbUBC14 ；表达分析

分类号 S794.1

泛素/26S蛋白酶体途径（Ubiquitin/26S Proteasome Pathway，UPP）是生物体内最重要且高效的选择性降解蛋白质途径，对生物体维持正常生命活动至关重要。UPP主要由泛素激活酶（ubiquitin activating enzyme，E1）、泛素结合酶（ubiquitin conjugating enzyme，UBC/E2）、泛素蛋白连接酶（ubiquitin-protein ligase，E3）和26S蛋白酶体组成。在UPP中，泛素（Ubiquitin，Ub）是一个可被重复利用识别靶蛋白的信号，Ub聚合体通过三步酶接合级联反应与靶蛋白共价结合，最终导致靶蛋白被26 S蛋白酶体降解为较小的多肽、氨基酸，同时可被重复利用的Ub释放出来[1]。作为高效、专一性和选择性强的蛋白降解途径，UPP几乎涉及植物发育机制的所有方面，其核心是激素反应，包括激素合成、感知和下游信号传导[2-5]。

E2是催化泛素与底物蛋白结合的第二个酶，在UPP酶接合级联反应中E2发挥着桥梁和纽带的作用。E2在UBC结构域内含有一个高度保守的半胱氨酸（cysteine）位点，接受从E1泛素复合物转移过来的活化泛素分子后，形成E2-Ub复合物。在E3的协同作用下，E2-Ub复合物把活化的泛素分子转移到底物蛋白上，形成单泛素化或多聚泛素化蛋白，具有泛素标记的蛋白最终被26S蛋白酶体降解[6]。研究表明，E2在DNA修复、植物生长发育和胁迫应答等方面均发挥重要作用。真核生物复制后DNA修复主要由RAD6和RAD18控制，在以RAD6为中心的复制后DNA修复途径中，伤害诱导的PCNA泛素化是DNA修复的前提，而PCNA不同修饰则影响对DNA损伤的抗性[7-8]。DNA损伤诱导染色质相关蛋白磷酸化使RNF8和UBC13聚集到DNA损伤位点，RNF8-UBCl3复合物可独立完成泛素化，进而促RAP80和完整的Brcal A复合物在DNA损伤位点募集完成DNA修复[9-10]。在拟南芥基因组中至少存在37个E2基因，E2可部分决定蛋白泛素化效率和特异性[11]。AtUBC1、AtUBC2和AtUBC3与酵母RAD6基因同源，AtUBC2可互补酵母rad6突变体。AtUBC1和AtUBC2能通过上调拟南芥开花基因（FLC）表达抑制开花，AtUBC3则不参与开花过程的调控[12-14]。拟南芥类E2蛋白—COP10无E2活性，但可通过提高一些E2蛋白活性调控植物的的生长发育过程，UBC19和UBC20除参与分化细胞泛素化反应外，还在细胞周期中发挥关键作用[15-16]。除与DNA修复和植物生长发育相关，E2还在胁迫应答中发挥重要作用。徐晨曦等[17]从耐盐灌木柽柳中获得了一个E2基因，在烟草中异源表达E2基因证明，该基因能提高转基因烟草的耐旱性。Cui等[18]研究发现，拟南芥UBC32在油菜素内酯介导的植物生长和耐盐反应中发挥作用。

巴西橡胶树是一种重要的热带经济林木，它产生的胶乳是天然橡胶的主要原料。中国天然橡胶供需矛盾日益凸显，目前自给率已降至20%以下。中国植胶区域有限，因此提高单产是保障我国天然橡胶供给能力的唯一出路。在影响天然橡胶单产的因素中，橡胶树死皮是主要限制因子之一。Chua[19]研究发现，死皮橡胶树中可溶性蛋白质含量低于健康橡胶树，说明橡胶树死皮发生过程中蛋白质代谢以降解代谢为主。范思伟和杨少琼[20]研究发现，死皮发生发展过程中胶乳组织蛋白酶活性增加，表明乳管细胞蛋白分解代谢增强。Li等[21]进一步研究表明，UPP为橡胶树死皮发生关键调控途径之一。尽管以上研究表明，UPP在橡胶树在死皮中发挥重要作用，但有关UPP在橡胶树中的研究报道较少。本研究从巴西橡胶树中克隆了一个UBC基因—HbUBC14，对该基因进行了生物信息学及在不同组织、死皮和健康橡胶树胶乳、乙烯利（ET）和茉莉酸（JA）处理条件下的表达模式分析，以期为进一步揭示HbUBC14的生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

以优良巴西橡胶树品系热研7-33-97为实验材料，该材料于1990年定植于中国热带农业科学院试验农场五队，采用4 d 1刀、1/2螺旋割线加1.5%乙烯利刺激割胶，其中死皮树选用割面不排胶长度为2 cm至1/4割线间的橡胶树。不同组织及健康和死皮橡胶树胶乳均来源于上述材料；ET（乙烯利）和JA（茉莉酸）处理参考Hao和Wu[22]的方法进行，ET和JA的处理浓度分别为1%和0.3%。ET和JA处理植株为2003年定植于中国热带农业科学院试验农场七队的未开割幼树，以不作任何处理的幼树为对照，采集处理后0、4、8、24、48、72和120 h（只取ET处理样品）的胶乳。

1.2 总RNA提取及cDNA第一链合成

根据Xu等[23]的方法提取树皮、胶乳、叶片、花等组织总RNA，用DNase I处理去除RNA中残留的少量DNA。cDNA第一链合成按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书提供的方法和步骤进行。endprint

1.3 HbUBC14克隆及生物信息学分析

根据橡胶树已知基因片段（TSA：JR349640.1和JT967526.1）拼接序列设计引物HbUBC14F和HbUBC14R（表1），用PyrobestTM DNA酶进行PCR扩增并测序扩增产物以验证基因序列。扩增程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸7 min。扩增产物回收后连接到pMD18-T载体，挑取阳性克隆送公司测序。

利用DNAstar 7.0查找序列开放阅读框并翻译成蛋白的分子量和等电点。利用在线NCBI保守结构域数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析HbUBC14蛋白保守结构域、活性部位、硫酯中间体互作残基和E3互作残基。

1.4 HbUBC14表达分析

根据HbUBC14基因序列设计特异引物HbUBC14-RTF和HbUBC14-RTR（表1），以橡胶树18S RNA基因作为内参，采用半定量PCR分析HbUBC14在巴西橡胶树不同组织、死皮和健康橡胶树胶乳及ET和JA处理条件下的表达模式。半定量PCR扩增程序为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸35 s，30～35个循环；72℃延伸7 min，扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，然后用凝胶成像仪扫描胶图。

2 结果与分析

2.1 HbUBC14克隆及序列分析

在分析健康橡胶树树皮转录组测序数据时发现，2个基因片段（TSA：JR349640.1和JT967526.1）与UBC高度相似[24-25]。通过组装2个基因片段获得长653 bp基因，为验证拼接序列，在基因两端设计引物HbUBC14F和HbUBC14R并进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，连接pMD18-T载体并测序。测序结果表明，该基因长653 bp，最长开放阅读框504 bp（图1）；以获得基因为查询序列，在NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.org）进行BLASTX比对，发现该预测蛋白具有一段高度保守的UBC结构域，与拟南芥At3g55380蛋白高度相似，而At3g55380蛋白为拟南芥E2成员UBC14，因此，将从巴西橡胶树中得到的基因命名为HbUBC14。

2.2 HbUBC14生物信息学分析

HbUBC14蛋白包含167个氨基酸，预测分子量为18.66 ku，等电点为5.128。以HbUBC14氨基酸为查询序列，利用NCBI网站在线保守结构域数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测HbUBC14蛋白保守结构域。从第9到第160位氨基酸为保守的UBC结构域区。此外，HbUBC14还预测到1个活性半胱氨酸位点（第90位）、21个泛素硫酯中间体互作残基和5个E3互作残基（图1）。UBC结构域及上述特征对HbUBC14行使E2功能至关重要。

2.3 HbUBC14在不同组织及死皮和健康橡胶树胶乳中的表达分析

以Hb18S rRNA为内参，利用半定量RT-PCR方法分析HbUBC14在不同组织及死皮和健康橡胶树胶乳中的表达模式。结果表明，HbUBC14在巴西橡胶树胶乳中高表达，接下来是叶片、雌花、雄花、树皮和花药（图2A）。如图2B所示，与健康橡胶树胶乳相比，HbUBC14在死皮橡胶树胶乳中表达量明显下降。

2.4 HbUBC14在乙烯和茉莉酸处理条件下的表达模式分析

HbUBC14在乙烯和茉莉酸处理条件下的表达模式分析如图3所示。ET和JA处理均能调控HbUBC14基因表达。在ET处理下，HbUBC14表达在8 h开始上升，24 h达最大值，之后开始下降，72和120 h基本维持在8h表达水平（图3A）。与ET处理不同，JA处理后HbUBC14表达量持续增加，处理4和8 h 时有所上升，24 h表达量明显增加，72 h表达量达到最大值（图3B）。

3 讨论

E2是UPP的一个重要成员，在UPP酶接合级联反应中起到桥梁和纽带的作用[6]。本研究克隆了1个橡胶树E2成员—HbUBC14，生物信息学分析表明，HbUBC14同其它生物E2蛋白一样，含有高度保守的UBC结构域、半胱氨酸活性位点、泛素硫酯中间体互作残基和E3互作残基，根据以上特征推测HbUBC14可行使E2蛋白功能。序列比对发现，HbUBC14与拟南芥AtUBC14相似性最高，但AtUBC14功能仍不清楚，因此不能通过AtUBC14推测HbUBC14功能[26]。本研究发现HbUBC14表达无组织特异性，但在胶乳中高表达，说明HbUBC14可能在橡胶树胶乳生物合成和代谢中具有重要作用。与健康橡胶树相比，死皮橡胶树中可溶性蛋白质含量显著低于健康橡胶树，死皮发生发展过程中胶乳组织蛋白酶活性增加，说明乳管细胞蛋白分解代谢增强[19-20]。Li等[21]研究发现，死皮相关基因在UPP途径中富集，提出UPP是橡胶树死皮发生关键调控途径。UPP是高度选择性的蛋白降解途径，E2作为UPP途径中的关键成员必然在蛋白选择性降解中发挥重要作用。RT-PCR分析结果表明，HbUBC14在健康橡胶树胶乳中高表达，而在死皮橡胶树胶乳中基本无表达，其是否与死皮橡胶树蛋白含量低相关，还需要进一步实验验证。

在橡胶树中，对ET和JA两个激素的研究和应用较为深入。ET作为橡胶树增产刺激剂，通过延长排胶时间提高橡胶产量[27]，而过度割胶和强乙烯利刺激容易诱发橡胶树死皮[20]；JA能诱导橡胶树乳管分化，乳管分化能力和数目多少是橡胶树是否高产的一个重要标志[22]。本研究结果表明，ET和JA可调控HbUBC14表达，因此可能与ET和JA信号转导相关。综合本研究结果，推测HbUBC14为多功能基因，可能参与橡胶树死皮、ET和JA信号转导、胶乳再生和乳管分化等过程。HbUBC14基因克隆、生物信息学及表达分析为进一步研究HbUBC14在橡胶树中的生物学功能奠定了基础。endprint

参考文献

[1] Glickman M H， Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway：destruction for the sake of construction[J]. Physiol Rev， 2002， 82（2）：373-428.

[2] Vierstra R D. The ubiquitin26S proteasome system at the nexus of plant biology[J]. Nat Rev Mol Cell Bio， 2009， 10： 385-397.

[3] Stone S L， Callis J. Ubiquitin ligases mediate growth and development by promoting protein death[J]. Curr Opin Plant Biol， 2007， 10： 624-632.

[4] Santner A and Estelle M. The ubiquitin-proteasome system regulates plant hormone signaling[J]. The Plant Journal， 2010， 61： 1 029-1 040.

[5] Tan X， Zheng N. Hormone signaling through protein destruction： a lesson from plants[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab， 2009， 296： E223-227.

[6] Pickart C M. Mechanisms underlying ubiquitination[J]. Annu Rev Biochem， 2001， 70： 503-533.

[7] Broomfleld S， Hryciw T， Xian W. DNA postreplication repair and mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae[J]. Mutat Res， 2001， 486（3）： 167-184.

[8] Hoege C， Pfander B， Moldovan G L， et al.RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO[J]. Nature， 2002， 419： 135-141.

[9] Wang B， Elledge S J. Ubc13/Rnf8 ubiquitin ligases control foci formation of the Rap80/Abraxas/Brca1/Brcc36 complex in response to DNA damage[J]. PNAS， 2007， 104（52）： 20 759-20 763.

[10] Huen M S Y， Huang J， Yuan J S， et al. Noncanonical E2 variant-independent function of UBC13 in promoting checkpoint protein assembly[J]. Mol Cell Biol， 2008， 28（19）： 6 104-6 112.

[11] Vierstra R D. Proteolysis in plants： mechanisms and functions[J]. Plant Mol Biol， 1996， 32： 275-302.

[12] Cao Y， Dai Y， Cui S， et al. Histone H2B monoubiquitination in the chromatin of FLOWERING LOCUS C regulates flowering time in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2008， 20（10）： 2 586-2 602.

[13] Zwim P， Stary S， Luschnig C， et al. Arabidopsis thaliana RAD6 homolog AtUBC2 complements UV sensitivity， but not N-end rule degradation deficiency， of Saccharomyces cerevisiae rad6 mutants[J]. Current Genetics， 1997， 32（5）： 309-314.

[14] Xu L， Menard R， Berr A， et al. The E2 ubiquitin-conjugating enzymes， AtUBC1 and AtUBC2， play redundant roles and are involved in activation of FLC expression and repression of flowering in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal， 2009， 57（2）： 279-288.

[15] Lau O S， Deng X W. Effect of Arabidopsis COP10 ubiquitin E2 enhancement activity across E2 families and functional conservation among its canonical homologues[J]. The Biochemical Journal， 2009， 418（3）： 683-690.endprint

[16] Criqui M C， De Almeida E J， Camasses A， et al. Molecular characterization of plant ubiquitin-conjugating enzymes belonging to the UbcP4/E2-C/UBCx/UbcH10 gene family[J]. Plant Physiol， 2002， 130（3）： 1 230-1 240.

[17] 徐晨曦，姜静，刘甜甜，等. 柽柳泛素结合酶基因（E2s）的序列分析及功能验证[J]. 东北林业大学学报，2007，35（11）：1-4.

[18] Cui F， Liu L， Zhao Q， et al. Arabidopsis ubiquitin conjugase UBC32 is an ERAD component that functions in brassinosteroid-mediated salt stress tolerance[J]. The Plant Cell， 2012， 24（1）： 233-244.

[19] Chua S E. Physiological changes in Hevea trees under intensive tapping[J]. J. Rubber Res. Inst. Malaya， 1967， 20（2）： 100-105.

[20] 范思伟，杨少琼. 强割和排胶过度引起的死皮是一种特殊的局部衰老病害[J]. 热带作物学报，1995，16（2）： 15-22.

[21] Li D J， Deng Z， Chen C L， et al. Identification and characterization of genes associated with tapping panel dryness from Hevea brasiliensis latex using suppression subtractive hybridization[J]. BMC Plant Biol， 2010， 10： 140.

[22] Hao B Z， Wu J L. Laticifer differentiation in Hevea brasiliensis induction by exogenous jasmonic acid and linolenic acid[J]. Ann Bot， 2000， 85： 37-43.

[23] Xu J， Aileni M， Abbagani S， et al. A reliable and efficient method for total RNA isolation from various members of spurge family （Euphorbiaceae）[J]. Phytochem Anal， 2010， 21（5）： 395-398.

[24] Li D J， Deng Z， Qin B， et al. De novo assembly and characterization of bark transcriptome using Illumina sequencing and development of EST-SSR markers in rubber tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. BMC Genomics， 2012， 13： 192.

[25] Rahman A Y， Usharraj A O， Misra B B， et al. Draft genome sequence of the rubber tree Hevea brasiliensis[J]. BMC Genomics， 2013， 14 （1）： 75.

[26] Karft E， Stone S L， Ma L， et al. Genome analysis and functional characterization of the E2 and RING-type E3 ligase ubiquitination enzymes of Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2005， 139（4）： 1 597-1 611.

[27] Zhu J H， Zhang Z L. Ethylene stimulation of latex production in Hevea brasiliensis[J]. Plant Signaling & Behavior， 2009， 4： 1-3.endprint