柱花草茎段组织培养研究

单国燕等

摘 要 以‘热研2号柱花草茎段为外植体，研究不同激素种类及组合对试管苗诱导、增殖和生根的影响。结果表明：将带芽茎段接种在MS+6-BA 5.0 mg/L+GA3 0.5 mg/L的培养基中腋芽诱导率最高可达90%；最佳不定芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，其分化率达100%；最佳生根培养基为MS+IBA 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L。综上所述，该研究结果改变了丛生芽的产生途径，缩短了分化时间，提高了增殖速度，是快速繁殖柱花草苗的有效方法。

关键词 柱花草 ；茎段 ；组织培养

分类号 S541

Abstract In this experiment， the stems of Stylosanthes guianensis cv， Reyan2 were used as a material and the effects of hormones and their combinations on the propagation and rooting of the plantlets were also studied. The results showed that the highest frequency of shoot formation was obtained when explants（stem with buds） were cultured on MS+6-BA 5.0 mg/L+GA3 0.5 mg/L， the inducement rate of valid buds reached to 90%； The best adventitious bud proliferation medium was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L and the differentiation rate was up to 100%； The best rooting medium was MS+IBA 1.0 mg/L+IAA 1.0 mg/L. This research changed the way of producing tufted multiple shoot， shortened the time of differentiation， and raised the speed of proliferation， It is the available way to quickly propagate the Stylosanthes.

Keywords Stylosanthes ； stem ； tissue culture

柱花草属（Stylosanthes spp.）包括44个种和亚种，广泛分布于中南美洲、北美洲、非洲、东南亚和印度等地。适于生长在南北纬30°之间，平均生长周期为63～190 d[1-3]。中国于1962年首次自马来西亚引种柱花草到海南岛，作为橡胶园的覆盖作物[4]。柱花草还是优良的热带豆科牧草，其茎叶产量高，草品质好（干物质中粗蛋白质含量达15%以上）。柱花草耐旱、耐酸性瘦土，广泛用于改良天然草地，作为放牧及制作草粉，同时还可用作果园等的覆盖作物、保持水土和提高土壤肥力等。

国外在20世纪60年代就开展了柱花草的组织培养研究[5-6]，大多是用无菌苗的子叶和幼茎作为外植体进行诱导和培养，然而通过茎尖和茎段培养诱导丛生苗国内外鲜有报道，且没有图片显示其再生体系的建立过程。茎段培养是一项在作物上应用较为广泛的生物技术，具有取材方便、分化时间缩短、增殖倍数提高、再生植株能保持母本的优良性状等优点，在生产中具有很大的潜在应用价值。但在柱花草茎段培养过程中，真菌和细菌污染都十分严重，有时甚至高达100%，导致培养失败，因此，本研究以中国大面积推广种植的优良品种‘热研2号柱花草茎段为外植体，对影响其组织培养的外植体消毒方法和激素配比等重要因素进行研究，为柱花草的茎段培养提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 外植体

实验所用材料为‘热研2号柱花草中上部带芽茎段，取自中国热带农业科学院热带牧草研究中心。‘热研2号柱花草是中国热带农业科学院农牧研究所选育的高产、优质、耐病品种，目前它在中国柱花草栽培品种中推广面积最大。

1.1.2 试剂

实验所用试剂有：多菌灵、百菌清、杀毒钒、羧卞青霉素钠、噻孢霉素、链霉素、四环素、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、KT（激动素）、NAA（萘乙酸）、GA3（赤霉素）和IBA（吲哚丁酸）。

1.2 方法

1.2.1 外植体处理及消毒

对照（CK）：选择生长健壮的植株，切取5 cm左右的外植体茎段，每3个芽分别剪成一段，用肥皂水浸泡7～8 min，流水冲洗20 min。将洗净的外植体在超净工作台上进行常规消毒：75%酒精浸泡1 min，1 g/L升汞消毒10 min，最后用无菌水冲洗4～5次。处理1：1 g/L多菌灵，处理2：1 g/L多菌灵+1 g/L百菌清+1 g/L杀毒钒；处理3：1 g/L多菌灵+800 mg/L的羧卞青霉素钠；处理4：1 g/L多菌灵+500 mg/L的噻孢霉素；处理5：1 g/L多菌灵+500 mg/L的羧卞青霉素钠+250 mg/L的噻孢霉素；处理6：1 g/L多菌灵+800 mg/L的羧卞青霉素钠+500 mg/L的噻孢霉素；处理7：1 g/L多菌灵+800 mg/L的羧卞青霉素钠+500 mg/L的噻孢霉素+50 mg/L链霉素+25 mg/L四环素。外植体在处理1～7溶液中，置于130 r/min摇床上振荡2.5 h，然后在超净工作台上常规消毒。

1.2.2 不同激素配比试验endprint

芽诱导培养实验：将柱花草茎段接种在不同的芽诱导培养基上，以MS为基本培养基，附加1、2、3、4、5、10 mg/L的6-BA，1、1.5、2 mg/L的KT，0.5、1、2 mg/L的NAA，0.5、1 mg/L的GA3，共12个处理，每个处理重复4次。2周后统计芽诱导率，期间观察诱导出的芽的生长状况。

芽增殖培养实验：将诱导培养基上已萌发的嫩芽切下，转接入增殖培养基上。以MS为基本培养基，附加0.5、1、2、4 mg/L的6-BA，1、1.5 mg/L的KT，0.5、1 mg/L的NAA，0.5 mg/L的GA3，共8个处理，每个处理重复4次。20 d后统计嫩芽的分化率和苗长势。

生根培养实验：剪取约5 cm的带叶和芽的增殖茎段用于生根培养实验。设IBA添加浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L，IAA添加浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0 mg/L，共4个处理，每个处理重复4次。

1.2.3 培养条件

MS培养基（附加蔗糖30 g/L，琼脂粉7 g/L，pH 5.8），温度25～28℃，光照强度1 500～2 000 lx，光照时间14 h/d。每瓶接种1个带芽茎段，20 d后统计污染和生长情况。

1.3 数据处理

定期观察柱花草的茎段生长状况并记录拍照，计算主要统计指标：污染率/%=污染的外植体数/外植体总数×100%，诱导率/%=诱导出不定芽的外植体数/接种的外植体数×100%，分化率/%=分化的外植体数/总外植体数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌剂与抗生素处理及浓度对污染控制的效果

杀菌剂和抗生素的不同处理及浓度对柱花草污染控制的效果见表1。由表1可以看出，柱花草的茎段培养非常容易受细菌和真菌的污染，在对照中，常规消毒对柱花草污染的控制完全不起作用，如预处理1～4中，无论是单独使用多菌灵，还是多菌灵和百菌清、杀毒钒、羧卞青霉素、钠塞孢霉素中的1种或2种配合使用，柱花草茎段培养的污染率都为100%。从处理5（1 g/L多菌灵+500 mg/L的羧卞青霉素钠+250 mg/L的噻孢霉素）开始，其污染率开始降低到56.0%，可见羧卞青霉素钠和噻孢霉素对柱花草的真菌污染和细菌污染都有一定的抑制作用；继续增加羧卞青霉素钠和噻孢霉素的使用浓度，污染率也随之降低到46.0%，所以800 mg/L的羧卞青霉素钠和500 mg/L的噻孢霉素是较好的使用浓度；在处理6中再添加50 mg/L链霉素和25 mg/L四环素，污染率降低至36.0%，因此，处理7（1 g/L多菌灵+800 mg/L的羧卞青霉素钠+500 mg/L的噻孢霉素+50 mg/L链霉素+25 mg/L四环素）对柱花草污染率的控制具有非常显著的抑制作用。

2.2 不同激素配比对柱花草茎段腋芽萌动和抽芽的影响

茎段培养的目的是诱导茎段腋芽萌动抽芽，不同激素配比对柱花草茎段腋芽萌动和抽芽的影响见表2和表3。

2周后，观察培养结果（表2）表明：①KT和GA3是影响柱花草茎段腋芽萌动的重要激素。2周内都已经有腋芽陆续抽出，当单独或同时使用6-BA时，茎段很难诱导腋芽萌动抽芽，培养很长时间腋芽才有萌动，个别芽眼抽芽，但只抽叶柄，且芽弱；同量的6-BA配合低浓度KT能较好、较快地促进腋芽的萌动。②NAA对柱花草茎段腋芽萌动有抑制作用。在能很好诱导茎段萌动抽芽的配方中加入NAA后，茎段的萌动抽芽严重受抑制，2周内，未见腋芽抽出。

3周后，观察培养结果（表3）显示：①处理7～12均有腋芽抽出，但抽芽时间比未添加NAA的组合要迟1周，并且芽诱导率也低于未添加NAA的组合。②虽然处理1的出芽时间和出芽数量在2周前优于其他组合，但3周后，处理6的芽诱导率达90.0%，远远高于处理1的65.0%，并且芽长势也明显好于处理1（图1）。由此推知，GA3是诱导柱花草茎段腋芽萌动的较好激素。诱导柱花草茎段萌动的最好激素组合是：MS+6-BA 5.0 mg/L+GA3 0.5 mg/L。

2.3 不同激素配比对柱花草茎段芽增殖的影响

在组织培养中，细胞分裂素和生长素的适当配比决定试管苗的生长与分化。提高细胞分裂素浓度有利于芽的产生，增加生长素浓度有利于组织和器官的生长。柱花草茎段增殖培养的目的是为了使苗既有较高的增殖速度又能保持较好的长势，因此，本实验设计了8种培养基，其增殖表现见表4。结果表明：①KT是影响柱花草茎段腋芽萌动的重要激素。当单独使用6-BA时，萌芽抽出较慢，当在6-BA基础上添加少量生长素（如NAA）后，萌动腋芽能很快抽出。②6-BA和KT配合使用的增殖效果，好于单独使用1种分裂素的效果。③NAA是促进柱花草茎段萌动芽增殖的重要激素。当不使用NAA时，诱导萌动的腋芽很难抽枝增殖，当添加少量NAA时，能显著提高抽枝能力。④能较好促进柱花草茎段芽增殖的培养基是B7号培养基（图2）。

2.4 增殖茎段的生根情况

剪切约5 cm的带叶和芽的增殖茎段插到生根培养基上。不同激素对柱花草增殖茎段生根的影响结果（表5）表明：①处理C2的生根效果最好（图3）。②柱花草增殖茎段生根对NAA敏感，NAA浓度稍高或稍低都会引起大量落叶和茎段枯死，因此，生根培养基中使用的NAA浓度范围较窄。③继代前用高浓度NAA溶液浸泡处理能促进抽根。

3 讨论与结论

3.1 提高柱花草茎段外植体的利用率是影响其组织培养效率的关键环节

柱花草茎段组织培养中遇到的主要问题是外植体的污染，因为柱花草为多年生半直立草本植物，茎被茸毛，且喜潮湿的热带气候[7]，这些对微生物的生长繁殖十分有利。在野外采集的柱花草茎段一般带菌较多，造成常规组织培养污染率很高，几乎为100%。要建立柱花草茎段的组织培养体系，植物材料的消毒至关重要。因此，有效的消毒方法是提高外植体利用率的有效途径，是柱花草茎段组织培养的关键环节。多种抗菌素的配合使用对柱花草茎段组织培养的污染有很好的抑制作用。endprint

3.2 不同种类的培养基对茎段腋芽萌发和生长的影响

植物萌发生长所需要的营养元素不一样，其浓度也不一样，因此选择适合本品种的培养基是其正常生长增殖生根的关键[8]。在本实验中，以茎段为外植体，从萌发率、增殖系数和生长状况综合考虑，A6培养基最适合柱花草茎段的启动培养。

3.3 增殖培养

组织培养中用腋芽或不定芽增殖的途径来扩大繁殖有利于保持遗传的稳定性，而且在培养多代后仍然保持着旺盛的增殖能力[9]。该实验采用萌发枝条诱导出的不定芽增殖，结果获得了较高数量的丛生芽。

3.4 激素种类及配比是影响柱花草茎段组织培养的重要因素

在基本培养基一致的情况下，适当调整激素的种类和用量，柱花草茎段诱导、增殖和生根的差异明显，因此，激素种类及配比是影响柱花草茎段组织培养的重要因素。细胞分裂素是组织培养中诱导芽产生不可缺少的外源激素，其浓度对外植体诱导形成芽起着至关重要的作用，高水平的细胞分裂素倾向于诱导不定芽的形成，也使侧芽增生迅速，结果产生大量过于细密的嫩茎，同时嫩茎的质量下降，不利于下一步的生根移栽。

3.5 柱花草茎段组织培养为加速柱花草快繁技术提供了新途径

国外柱花草的组织培养研究始于1976年，获得成功的品种有：有钩柱花草[10]、矮柱花草[11]、库克柱花草[12]、圭亚那柱花草[13]等。其中胚根、胚轴和子叶的组织培养是研究较早较多的方向，但由于以这些材料为外植体的组织培养需要经过愈伤诱导、脱分化愈伤诱导、芽增殖、根诱导等阶段，整个过程周期长，增殖效率不高，同时，外植体采样受生长期的影响，限制了柱花草组培苗在生产上的广泛应用。而柱花草茎段的组织培养只有芽诱导、芽增殖和根诱导等阶段，周期短，且外植体采样不受时间的限制，其组织培养的成功能显著提高组培苗在生产上的应用水平。通过本实验结果证明，柱花草茎段组织培养效率高，从芽诱导到新抽枝条长到8～10 cm，只需60 d左右的时间，之后就可切取嫩枝继续继代增殖，诱导生根、成苗。这将是柱花草离体快繁的又一新途径。

参考文献

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[7] 刘国道. 热带牧草栽培学[M]. 北京：中国农业出版社，2006：150-159.

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[9] 张存旭，宋 敏，赵 忠. 栓皮栎茎段离体培养的研究[J]. 西北植物学报，2004，24（7）：1 260-1 265.

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[12] Meiger E G M，Steinbis H H. Plantet regeneration from suspension and protoplast cultures of the tropical Stylosanthes guyanensis（Aubl）[J]. Annals of Botany， 1983， 52（2）： 305-310.

[13] 唐湘梧. 热带牧草笔花豆生物工程技术研究[J]. 国外畜牧学. 草原与牧草，1989（1）：37-39.endprint

3.2 不同种类的培养基对茎段腋芽萌发和生长的影响

植物萌发生长所需要的营养元素不一样，其浓度也不一样，因此选择适合本品种的培养基是其正常生长增殖生根的关键[8]。在本实验中，以茎段为外植体，从萌发率、增殖系数和生长状况综合考虑，A6培养基最适合柱花草茎段的启动培养。

3.3 增殖培养

组织培养中用腋芽或不定芽增殖的途径来扩大繁殖有利于保持遗传的稳定性，而且在培养多代后仍然保持着旺盛的增殖能力[9]。该实验采用萌发枝条诱导出的不定芽增殖，结果获得了较高数量的丛生芽。

3.4 激素种类及配比是影响柱花草茎段组织培养的重要因素

在基本培养基一致的情况下，适当调整激素的种类和用量，柱花草茎段诱导、增殖和生根的差异明显，因此，激素种类及配比是影响柱花草茎段组织培养的重要因素。细胞分裂素是组织培养中诱导芽产生不可缺少的外源激素，其浓度对外植体诱导形成芽起着至关重要的作用，高水平的细胞分裂素倾向于诱导不定芽的形成，也使侧芽增生迅速，结果产生大量过于细密的嫩茎，同时嫩茎的质量下降，不利于下一步的生根移栽。

3.5 柱花草茎段组织培养为加速柱花草快繁技术提供了新途径

国外柱花草的组织培养研究始于1976年，获得成功的品种有：有钩柱花草[10]、矮柱花草[11]、库克柱花草[12]、圭亚那柱花草[13]等。其中胚根、胚轴和子叶的组织培养是研究较早较多的方向，但由于以这些材料为外植体的组织培养需要经过愈伤诱导、脱分化愈伤诱导、芽增殖、根诱导等阶段，整个过程周期长，增殖效率不高，同时，外植体采样受生长期的影响，限制了柱花草组培苗在生产上的广泛应用。而柱花草茎段的组织培养只有芽诱导、芽增殖和根诱导等阶段，周期短，且外植体采样不受时间的限制，其组织培养的成功能显著提高组培苗在生产上的应用水平。通过本实验结果证明，柱花草茎段组织培养效率高，从芽诱导到新抽枝条长到8～10 cm，只需60 d左右的时间，之后就可切取嫩枝继续继代增殖，诱导生根、成苗。这将是柱花草离体快繁的又一新途径。

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[13] 唐湘梧. 热带牧草笔花豆生物工程技术研究[J]. 国外畜牧学. 草原与牧草，1989（1）：37-39.endprint

3.2 不同种类的培养基对茎段腋芽萌发和生长的影响

植物萌发生长所需要的营养元素不一样，其浓度也不一样，因此选择适合本品种的培养基是其正常生长增殖生根的关键[8]。在本实验中，以茎段为外植体，从萌发率、增殖系数和生长状况综合考虑，A6培养基最适合柱花草茎段的启动培养。

3.3 增殖培养

组织培养中用腋芽或不定芽增殖的途径来扩大繁殖有利于保持遗传的稳定性，而且在培养多代后仍然保持着旺盛的增殖能力[9]。该实验采用萌发枝条诱导出的不定芽增殖，结果获得了较高数量的丛生芽。

3.4 激素种类及配比是影响柱花草茎段组织培养的重要因素

在基本培养基一致的情况下，适当调整激素的种类和用量，柱花草茎段诱导、增殖和生根的差异明显，因此，激素种类及配比是影响柱花草茎段组织培养的重要因素。细胞分裂素是组织培养中诱导芽产生不可缺少的外源激素，其浓度对外植体诱导形成芽起着至关重要的作用，高水平的细胞分裂素倾向于诱导不定芽的形成，也使侧芽增生迅速，结果产生大量过于细密的嫩茎，同时嫩茎的质量下降，不利于下一步的生根移栽。

3.5 柱花草茎段组织培养为加速柱花草快繁技术提供了新途径

国外柱花草的组织培养研究始于1976年，获得成功的品种有：有钩柱花草[10]、矮柱花草[11]、库克柱花草[12]、圭亚那柱花草[13]等。其中胚根、胚轴和子叶的组织培养是研究较早较多的方向，但由于以这些材料为外植体的组织培养需要经过愈伤诱导、脱分化愈伤诱导、芽增殖、根诱导等阶段，整个过程周期长，增殖效率不高，同时，外植体采样受生长期的影响，限制了柱花草组培苗在生产上的广泛应用。而柱花草茎段的组织培养只有芽诱导、芽增殖和根诱导等阶段，周期短，且外植体采样不受时间的限制，其组织培养的成功能显著提高组培苗在生产上的应用水平。通过本实验结果证明，柱花草茎段组织培养效率高，从芽诱导到新抽枝条长到8～10 cm，只需60 d左右的时间，之后就可切取嫩枝继续继代增殖，诱导生根、成苗。这将是柱花草离体快繁的又一新途径。

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