中药诃子的抑菌作用及超微构

刘伟+唐金花+周丽威+等

摘要：采用牛津杯法对14种中草药进行抑菌活性筛选，利用液体稀释法考察中药诃子（Fructus chebulae）对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度，观察中药诃子作用下3种菌株的超微结构变化。结果表明：诃子、黄芩、大蒜、苍术、青蒿、石榴皮、百部、茵陈、干姜等9种中草药对3种细菌都有抑制作用；连翘、夏枯草、白头翁、大黄、附子等5种中草药对3细菌则未见抑制作用。透射电镜下观察表明，经中药诃子作用4.5 h后，大肠杆菌细胞质与细胞壁出现明显分离，细胞质固缩，细胞中间出现腔隙。

关键词：诃子；抑菌作用；超微结构；最低抑菌浓度

中图分类号： R285文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0281-03

收稿日期：2013-09-24

基金项目：吉林省财政专项。

作者简介：刘伟（1980—），吉林大安人，讲师，从事植物病理学研究。E-mail：lwtong@163.com。

通信作者：唐金花，讲师，从事植物病理学研究。E-mail：hit1102tjh@aliyun.com。随着抗生素的广泛使用，细菌耐药性问题日益突出，开发新的抗菌药物成为新的研究热点[1]。由于中药具有特殊的抗菌机理及活性成分，细菌不易产生耐药性，因此，关于中药抗菌活性研究也越来越引起人们的关注。苦参、蒲公英、黄芩等多种中药都具有抗菌作用[2-4]。中药诃子（Fructus chebulae）别称诃梨或随风子，为双子叶植物纲使君子科植物诃子的干燥果实，具有抗氧化、抗癌、降血糖、抗病毒、涩肠、敛肺、降火利咽等功效[5]。本研究通过牛津杯法、液体稀释法，研究诃子的抑菌作用及超微结构，旨在为开发利用诃子资源提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料诃子、黄芩、大蒜、苍术、青蒿、石榴皮、百部、茵陈、干姜、连翘、夏枯草、白头翁、大黄、附子等14种中草药饮片均购于吉林省通化市老百姓大药房。

1.1.2试验菌株大肠杆菌（Escherichia coli）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginos）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由中国医学菌种保藏中心提供。

1.1.3培养基LB培养基配方：酵母浸膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，水1 000 mL，pH值7.2。

1.2方法

1.2.1中药水提物将14种中草药饮片共500 g粉碎，过200目筛，用5倍量蒸馏水冷浸3次，每次24 h，合并提取液并减压浓缩成浸膏状，经细菌过滤器除菌，置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2菌悬液制备将各菌株接种于LB液体培养基中，37 ℃ 130 r/min摇床扩大培养至对数生长期，利用血球计数板法将各菌株用培养基配制成浓度为100万CFU/mL的菌悬液。

1.2.314种中草药抑菌活性筛选将各种中草药水提物稀释成5 g/mL备用。取浓度为100万CFU/mL的各菌液1 mL分别加入25 mL LB琼脂培养基，混匀倒入平皿中，然后将灭菌的牛津杯置于培养基上。再将各种中草药溶液加入牛津小杯中，每个牛津小杯中加入200 μL，阴性对照为LB液体培养基。将平皿置于37 ℃恒温箱中培养，24 h后取出。测量抑菌圈半径，重复3次，计算平均值，考察不同中草药的抑菌活性[6]。

1.2.4中药诃子对3种菌株的敏感性试验将中药诃子分别稀释成5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 g/mL浓度后加入浓度为100万CFU/mL的各菌液牛津小杯中，以LB液体培养基为阴性对照，37 ℃恒温箱中培养24 h后观察，测量抑菌圈半径，重复3次，计算平均值，确定最低抑菌浓度（MIC）[7]。最低抑菌浓度（MIC）是指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。

1.2.5扫描电镜观察将100万CFU/mL大肠杆菌悬液加入0.625 g/mL诃子药液中，37 ℃下150 r/min振荡培养 4.5 h 后离心弃上清，用磷酸缓冲液洗涤沉淀3次，用戊二醛将沉淀固定2 h，按照扫描电镜生物样品制备方法[8]将沉淀制成标本，于KYKY-1000B扫描电镜下观察。正常未加药液的大肠杆菌同上制备作为对照。

1.2.6透射电镜观察将0.625 g/mL诃子药液作用的大肠杆菌培养4.5 h后离心取样，用磷酸缓冲液洗涤沉淀3次，将沉淀用戊二醛固定2 h，按照透射电镜样品制备方法制备样品[9]，在JEM-2000EX透射电镜下观察。正常未加药液的大肠杆菌同上制备作为对照。

2结果与分析

2.114种中草药的抑菌效果

诃子、黄芩、大蒜、苍术、青蒿、石榴皮、百部、茵陈、干姜等9种中草药对3种细菌都有抑制作用。连翘、夏枯草、白头翁、大黄、附子等5种中草药对3种细菌则未见抑制作用。诃子、黄芩、大蒜、苍术对3种细菌的抑制作用明显，其中诃子对所有菌株的抑制作用最为明显，抑菌圈半径均达到1.4 cm以上。因此，接下来试验选用诃子作进一步研究。

4种中草药水提物的抑菌作用

中草药抑菌圈半径（cm）大肠杆菌绿浓杆菌金黄色葡萄球菌诃子1.41.41.5黄芩1.01.00.9大蒜1.01.00.9苍术1.01.0 0.8青蒿0.70.80.6石榴皮0.60.60.6百部0.60.60.5茵陈0.60.50.5干姜0.50.60.5连翘夏枯草白头翁大黄附子注：空白表示没有抑菌圈出现。

2.2诃子水提物对3种细菌的抑菌作用及最低抑菌浓度

诃子水提物对大肠杆菌、绿脓杆菌（革兰氏阴性菌）、金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性菌）都有明显的抑菌作用，抑菌谱广。图1表明，诃子浓度与抑菌效果成正相关。采用液体倍比稀释法得出，大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为0.625 g/mL，在此浓度下对大肠杆菌的抑菌圈半径为0.55 cm。 表2不同浓度诃子水提物的抑菌作用endprint

菌株抑菌圈半径（cm）5 g/mL2.5 g/mL 1.25 g/mL0.625 g/mL0.312 5 g/mL阴性对照大肠杆菌1.451.201.050.75绿脓杆菌1.551.351.150.80金黄色葡萄球菌1.501.250.650.55注：空白表示没有抑菌圈出现。

2.3诃子水提物对大肠杆菌形态的影响

描电镜下观察表明，未受药物作用的大肠杆菌菌体呈短杆状，两端钝圆，菌体形态光滑而规则。经中药诃子作用4.5 h后，大肠杆菌菌体的两端向中间凹陷，同样放大倍数下比未受药物作用的菌体明显缩短）。

2.4诃子水提物对大肠杆菌结构的影响

透射电镜下观察表明，未受药物作用的大肠杆菌细胞壁、细胞膜结构完整、紧密，细胞基质均匀。经中药诃子作用4.5 h后，大肠杆菌的细胞质与细胞壁明显分离，部分细胞壁破损，菌体的细胞质固缩。这与王关林等的研究结论[2]相似。可见不同中药对不同菌体可能存在相同的作用机制。

3结论

本研究表明，诃子、黄芩、大蒜、苍术等中草药对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌效果均较好，以中药诃子的抑菌效果最为明显。诃子浓度与抑菌效果成正相关，对3种菌株的最低抑菌浓度均为0.625 g/mL。透射电镜下观察表明，经中药诃子作用4.5 h后，大肠埃希氏杆菌细胞质与细胞壁出现明显分离，细胞质固缩，细胞中间出现腔隙，这可能是因为经诃子作用后，细胞质中间的腔隙使得中间部位压力比菌体两端压力小，造成菌体缢缩。诃子作为传统的抗菌药物，其毒副作用小、来源广、价格低廉，较少出现耐药性，对3种致病菌有很强的抑制作用。

参考文献：

[1]刘华钢，申庆荣，刘丽敏. 中药抗菌作用研究进展[J]. 时珍国医国药，2010，21（2）：463-465.

[2]王关林，唐金花，蒋丹，等. 苦参对鸡大肠杆菌的抑菌作用及其机理研究[J]. 中国农业科学，2006，39（5）：1018-1024.

[3]刘华，吴国荣，孙晓明，等. 不同生境下的蒲公英及其不同器官的分段提取物抑菌作用比较研究[J]. 中国野生植物资源，2001，20（3）：35-36.

[4]张秀娟，李津明，霍明，等. 黄芩水煎液黄芩甙去黄芩甙水煎液抑菌试验比较[J]. 黑龙江商学院学报：自然科学版，1997，13（4）：6-9.

[5]张蕊. 诃子的提取工艺优化与抑菌活性研究[J]. 畜牧与饲料科学，2013，34（5）：13-16.

[6]陈曙霞. 苦参生物碱的药理研究进展[J]. 中成药，2003，25（1）：75-77.

[7]Zhang J P，Zhang M，Zhou J P，et al. Antifibrotic effects of matrine on in vitro and in vivo models of liverfibrosis in rats[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2001，22（2）：183-186.

[8]汤雪明，戴书文. 生物样品的环境扫描电镜观察[J]. 电子显微学报，2001，20（3）：217-223.

[9]朱丽霞. 生物学中的电子显微镜技术[M].endprint

菌株抑菌圈半径（cm）5 g/mL2.5 g/mL 1.25 g/mL0.625 g/mL0.312 5 g/mL阴性对照大肠杆菌1.451.201.050.75绿脓杆菌1.551.351.150.80金黄色葡萄球菌1.501.250.650.55注：空白表示没有抑菌圈出现。

2.3诃子水提物对大肠杆菌形态的影响

描电镜下观察表明，未受药物作用的大肠杆菌菌体呈短杆状，两端钝圆，菌体形态光滑而规则。经中药诃子作用4.5 h后，大肠杆菌菌体的两端向中间凹陷，同样放大倍数下比未受药物作用的菌体明显缩短）。

2.4诃子水提物对大肠杆菌结构的影响

透射电镜下观察表明，未受药物作用的大肠杆菌细胞壁、细胞膜结构完整、紧密，细胞基质均匀。经中药诃子作用4.5 h后，大肠杆菌的细胞质与细胞壁明显分离，部分细胞壁破损，菌体的细胞质固缩。这与王关林等的研究结论[2]相似。可见不同中药对不同菌体可能存在相同的作用机制。

3结论

本研究表明，诃子、黄芩、大蒜、苍术等中草药对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌效果均较好，以中药诃子的抑菌效果最为明显。诃子浓度与抑菌效果成正相关，对3种菌株的最低抑菌浓度均为0.625 g/mL。透射电镜下观察表明，经中药诃子作用4.5 h后，大肠埃希氏杆菌细胞质与细胞壁出现明显分离，细胞质固缩，细胞中间出现腔隙，这可能是因为经诃子作用后，细胞质中间的腔隙使得中间部位压力比菌体两端压力小，造成菌体缢缩。诃子作为传统的抗菌药物，其毒副作用小、来源广、价格低廉，较少出现耐药性，对3种致病菌有很强的抑制作用。

参考文献：

[1]刘华钢，申庆荣，刘丽敏. 中药抗菌作用研究进展[J]. 时珍国医国药，2010，21（2）：463-465.

[2]王关林，唐金花，蒋丹，等. 苦参对鸡大肠杆菌的抑菌作用及其机理研究[J]. 中国农业科学，2006，39（5）：1018-1024.

[3]刘华，吴国荣，孙晓明，等. 不同生境下的蒲公英及其不同器官的分段提取物抑菌作用比较研究[J]. 中国野生植物资源，2001，20（3）：35-36.

[4]张秀娟，李津明，霍明，等. 黄芩水煎液黄芩甙去黄芩甙水煎液抑菌试验比较[J]. 黑龙江商学院学报：自然科学版，1997，13（4）：6-9.

[5]张蕊. 诃子的提取工艺优化与抑菌活性研究[J]. 畜牧与饲料科学，2013，34（5）：13-16.

[6]陈曙霞. 苦参生物碱的药理研究进展[J]. 中成药，2003，25（1）：75-77.

[7]Zhang J P，Zhang M，Zhou J P，et al. Antifibrotic effects of matrine on in vitro and in vivo models of liverfibrosis in rats[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2001，22（2）：183-186.

[8]汤雪明，戴书文. 生物样品的环境扫描电镜观察[J]. 电子显微学报，2001，20（3）：217-223.

[9]朱丽霞. 生物学中的电子显微镜技术[M].endprint

菌株抑菌圈半径（cm）5 g/mL2.5 g/mL 1.25 g/mL0.625 g/mL0.312 5 g/mL阴性对照大肠杆菌1.451.201.050.75绿脓杆菌1.551.351.150.80金黄色葡萄球菌1.501.250.650.55注：空白表示没有抑菌圈出现。

2.3诃子水提物对大肠杆菌形态的影响

描电镜下观察表明，未受药物作用的大肠杆菌菌体呈短杆状，两端钝圆，菌体形态光滑而规则。经中药诃子作用4.5 h后，大肠杆菌菌体的两端向中间凹陷，同样放大倍数下比未受药物作用的菌体明显缩短）。

2.4诃子水提物对大肠杆菌结构的影响

透射电镜下观察表明，未受药物作用的大肠杆菌细胞壁、细胞膜结构完整、紧密，细胞基质均匀。经中药诃子作用4.5 h后，大肠杆菌的细胞质与细胞壁明显分离，部分细胞壁破损，菌体的细胞质固缩。这与王关林等的研究结论[2]相似。可见不同中药对不同菌体可能存在相同的作用机制。

3结论

本研究表明，诃子、黄芩、大蒜、苍术等中草药对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌效果均较好，以中药诃子的抑菌效果最为明显。诃子浓度与抑菌效果成正相关，对3种菌株的最低抑菌浓度均为0.625 g/mL。透射电镜下观察表明，经中药诃子作用4.5 h后，大肠埃希氏杆菌细胞质与细胞壁出现明显分离，细胞质固缩，细胞中间出现腔隙，这可能是因为经诃子作用后，细胞质中间的腔隙使得中间部位压力比菌体两端压力小，造成菌体缢缩。诃子作为传统的抗菌药物，其毒副作用小、来源广、价格低廉，较少出现耐药性，对3种致病菌有很强的抑制作用。

参考文献：

[1]刘华钢，申庆荣，刘丽敏. 中药抗菌作用研究进展[J]. 时珍国医国药，2010，21（2）：463-465.

[2]王关林，唐金花，蒋丹，等. 苦参对鸡大肠杆菌的抑菌作用及其机理研究[J]. 中国农业科学，2006，39（5）：1018-1024.

[3]刘华，吴国荣，孙晓明，等. 不同生境下的蒲公英及其不同器官的分段提取物抑菌作用比较研究[J]. 中国野生植物资源，2001，20（3）：35-36.

[4]张秀娟，李津明，霍明，等. 黄芩水煎液黄芩甙去黄芩甙水煎液抑菌试验比较[J]. 黑龙江商学院学报：自然科学版，1997，13（4）：6-9.

[5]张蕊. 诃子的提取工艺优化与抑菌活性研究[J]. 畜牧与饲料科学，2013，34（5）：13-16.

[6]陈曙霞. 苦参生物碱的药理研究进展[J]. 中成药，2003，25（1）：75-77.

[7]Zhang J P，Zhang M，Zhou J P，et al. Antifibrotic effects of matrine on in vitro and in vivo models of liverfibrosis in rats[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2001，22（2）：183-186.

[8]汤雪明，戴书文. 生物样品的环境扫描电镜观察[J]. 电子显微学报，2001，20（3）：217-223.

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