碱液冷提法提取程海螺旋藻中的多糖

李会端+秦志玉

摘要：采用碱液冷提法提取程海螺旋藻中的多糖，用显色法进行定性检验，以葡萄糖标准溶液为对照进行测定提取液中多糖的含量并计算提取率。通过单因素试验初步探究了氢氧化钠浓度、料液比、浸提时间3个试验条件对程海螺旋藻中多糖提取率的影响，通过正交试验最终确定碱液冷提法提取程海螺旋藻中多糖的最佳试验条件。试验结果表明，氢氧化钠浓度0.4 mol/L、料液比1 ∶25、提取时间2 h为较佳提取条件，测得程海螺旋藻中多糖的提取率为4524%。

关键词：碱液冷提法；钝顶螺旋藻；多糖；提取工艺；提取率

中图分类号： S937.3；R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0255-03

收稿日期：2013-09-23

基金项目：云南省应用基础研究项目（编号：2012FD050）；楚雄师范学院科学研究基金（编号：11YJGG01）。

作者简介：李会端（1983—），女，河北宁晋人，博士研究生，讲师，主要从事天然产物的化学成分分析及应用研究。 E-mail：lhd08@cxtc.edu.cn。多糖是指由10个以上的单糖通过糖苷键连成的高分子聚合物，是生命赖以存在的四大基本物质之一，按其来源可分为植物多糖、动物多糖、微生物多糖、藻类多糖，其中植物多糖和微生物多糖研究较多，藻类多糖研究相对较少。研究发现藻类多糖具有显著的抗病毒、抗肿瘤功能，能抑制癌细胞合成和增殖，提高肌体免疫力，从藻类中提取的多糖类药物具有显著的抗艾滋病的功效[1]。对多糖的研究已成为21世纪医药界的热门领域。螺旋藻属于蓝藻门蓝藻纲螺旋藻属，螺旋藻含有多种生物活性物质，具有重要的保健功能和药用价值，在食品保健、医药和化妆品等行业有广泛应用[2]。多糖类化合物是螺旋藻中重要的生物活性物质之一，对其进行提取和应用开发研究具有重要的研究价值。多糖类化合物的提取方法有热水浸提法、碱液冷提法、酸浸提法、酶解法和超声提取法[3]。螺旋藻呈弱碱性，不宜采用酸浸提法，而螺旋藻种类和提取方法不同，多糖提取率有很大差异[4-7]。本研究选用丽江程海螺旋藻（属于钝顶螺旋藻）为原料，用碱液冷提法提取螺旋藻中的多糖，显色反应进行定性检验，优化提取条件，从而确定较佳的提取工艺，以期为程海螺旋藻的开发利用提供基础的试验数据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

丽江程海螺旋藻干粉由丽江永程生物科技开发有限公司提供，置于恒温干燥箱中干燥至恒重备用。

葡萄糖（天津市风船化学试剂科技有限公司）、苯酚（广东光华科技股份有限公司）、硫酸（成都市科龙化工试剂厂）、氢氧化钠（广东光华科技股份有限公司）、三氯乙酸（广东光华化学厂有限公司）、95%乙醇（天津市风船化学试剂科技有限公司）、无水乙醇（天津市风船化学试剂科技有限公司）、丙酮（成都市科龙化工试剂厂），以上试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

722型光栅分光光度计（山东高密分析仪器厂）、80-2离心机（江苏大地自动化仪器厂）、SHZ-S2S循环水式真空泵（巩义市大地自动化仪器厂）、电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）。

1.3试验方法

1.3.1葡萄糖标准溶液的配制用电子天平准确称取干燥至恒重的葡萄糖标准品0.0200 g，在烧杯中用蒸馏水溶解，再转移至100 mL容量瓶中稀释定容，配制成0.2 mg/mL的葡萄糖标准溶液，备用。

1.3.2苯酚溶液的配制用电子天平准确称取5.000 0 g苯酚，在烧杯中用蒸馏水溶解，再转移至100 mL容量瓶中稀释定容，配制成5%的苯酚溶液（现配现用）。

1.3.3测定方法依据以葡萄糖标准液为对照品测定螺旋藻中多糖的含量，加入苯酚和浓硫酸，使多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，在可见光区获得稳定的特征吸收峰。

1.3.4螺旋藻中多糖提取率计算方法

多糖提取率=稀释倍数×测定溶液浓度×容量瓶体积样品质量×100%

将吸光度代入线性回归方程，计算提取液浓度，再代入上式计算螺旋藻中多糖提取率。

2试验与结果分析

2.1最大吸收波长的确定

用吸量管分别移取1.00 mL的葡萄糖标准液、螺旋藻提取液于2支25 mL比色管中，分别加入5%苯酚溶液 1.00 mL，再迅速滴加浓硫酸5.00 mL，混合摇匀，用蒸馏水稀释定容至10 mL刻度，静置冷却至室温。以试剂空白作对照，在400～550 nm 波长范围内测吸光度，确定最大吸收峰波长。

吸光度测定扫描结果见图1。初始阶段，葡萄糖标准液和螺旋藻提取液的吸光度都随着测定波长的增加而增大，当波长增加到490 nm时两者都达到最大吸收峰值，而后随着波长增加，吸收峰开始减小，因此选择490 nm为最大吸收波长，此后的吸光度均在490 nm波长下测定。

2.2葡萄糖标准曲线的绘制

用吸量管分别移取0.2 mg/mL的葡萄糖标准溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于6支25 mL比色管中，各加入5% 苯酚溶液1.00 mL，再迅速滴加浓硫酸 5.00 mL，混合摇匀，用蒸馏水稀释定容至10 mL刻度，静置冷却至室温，以第1支比色管为空白对照，在最大吸收峰波长处（490 nm）用722型光栅分光光度计测量吸光度。根据试验数据绘制葡萄糖标准曲线，如图2所示。根据葡萄糖标准曲线得线性回归方程为y=8.862 86x-0.0208 7，相关系数 r=0.998 6。其中y为吸光度，x为提取液中多糖的浓度。

2.3多糖定性试验

苯酚-硫酸反应：取几滴螺旋藻提取液于试管中，用胶头滴管滴加3～5滴5%苯酚溶液，混合摇匀后再滴加3～5滴浓硫酸，观察试验现象。endprint

蒽酮-硫酸反应：取几滴螺旋藻提取液于试管中，用胶头滴管滴加3～5滴蒽酮溶液，混合摇匀后再滴加3～5滴浓硫酸，观察试验现象。

α-萘酚-硫酸反应：取几滴螺旋藻提取液于试管中，用胶头滴管滴加3～5滴α-萘酚溶液，混合摇匀后再滴加3～5滴浓硫酸，观察试验现象。

将螺旋藻提取液多糖定性试验结果列于表1。螺旋藻提取液反应试验结果均与多糖类化合物显色反应试验结果相同，证明螺旋藻提取液中含多糖类化合物。

螺旋藻提取液多糖定性试验结果

试剂苯酚-硫酸蒽酮-硫酸α-萘酚-硫酸现象溶液颜色由无

色变成橙红色溶液颜色呈墨

绿色有紫红色环产生

2.4单因素试验结果与分析

2.4.1氢氧化钠浓度对多糖提取率的影响用电子天平准确称取2.000 0 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，分别用30 mL不同浓度的氢氧化钠溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）浸提2 h，过滤，将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸发浓缩至10 mL，待其冷却至室温，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振荡5 min使其混合均匀，再静置5 h（除蛋白质），将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，静置过夜（进行醇沉），以4 000 r/min离心10 min，弃上清液，依次用无水乙醇、丙酮洗剂沉淀数次，将洗剂后的沉淀在烧杯中溶解并转移至100 mL容量瓶中定容，测其吸光度，计算提取液中多糖的提取率。氢氧化钠浓度对多糖提取率影响结果如图3所示。

开始阶段，随着提取液氢氧化钠溶液浓度的增加，多糖提取率也不断增加，当氢氧化钠溶液浓度超过0.4 mol/L，多糖提取率开始降低。碱液浸提有助于破坏细胞壁聚合物分子的结构，从而提高多糖提取率，但碱液浓度过高则与多糖类化合物发生脱酯反应和消去反应从而破坏多糖结构，根据试验结果，最终确定0. 4mol/L为较佳的氢氧化钠提取液浓度。

2.4.2料液比对多糖提取率的影响用电子天平准确称取2.0000 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，固定提取液氢氧化钠溶液的浓度为0.4 mol/L，调变料液比分别为1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL，碱液浸提2 h，过滤，将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸发浓缩至10 mL，待其冷却至室温，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振荡5 min，再静置5 h（除蛋白质），将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液，加入 80 mL 95%乙醇，静置过夜（进行醇沉），以4 000 r/min离心10 min弃去上清液，依次用无水乙醇、丙酮洗剂沉淀数次，将洗剂后的沉淀在烧杯中溶解并转移至100 mL容量瓶中定容，测其吸光度，计算提取液中多糖的提取率。料液比对螺旋藻多糖提取率的影响结果如图4所示。

开始阶段，随着料液比的增加，多糖提取率也不断增加，当料液比超过1 g ∶25 mL后，多糖提取率开始降低。料液比越大，螺旋藻细胞壁作为半透膜两侧多糖浓度差越大，有利于多糖浸出，但料液比太大，使得多糖在蒸发浓缩过程中损失加剧，从而降低多糖提取率。综合考虑，选取1 g ∶25 mL为多糖提取的较佳料液比。

2.4.3浸提时间对多糖提取率的影响用电子天平准确称取2.0000g干燥至恒重的螺旋藻粉末，用50mL浓度为

0.4 mol/L 的氢氧化钠溶液分别浸提0.5、1、1.5、2、2.5 h，过滤，将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸发浓缩至10 mL，待其冷却至室温加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，振荡5 min，再静置5 h（除蛋白质），将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，静置过夜（进行醇沉），以 4 000 r/min 离心10 min弃去上清液，依次用无水乙醇、丙酮洗剂沉淀数次，将洗剂后的沉淀在烧杯中溶解并转移至 100 mL 容量瓶定容，测其吸光度，计算提取液中多糖的提取率。浸提时间对螺旋藻多糖提取率的影响结果见图5。

浸提时间延长，多糖提取率也逐渐增加，当浸提时间超过1.5 h后，多糖提取率开始降低。原因可能是随着浸提时间的延长，部分多糖降解为可溶于乙醇的单糖、寡糖或低聚糖，在醇沉过程中溶解损失，导致多糖提取率降低。综上试验，选取1.5 h为螺旋藻中多糖提取的较佳浸提时间。

2.5正交试验结果与分析

在单因素试验的基础上，以氢氧化钠溶液浓度、料液比、浸提时间为变量，多糖提取率为考察指标，考察这3个变量因素对多糖提取率的影响。设计3因素3水平的正交试验，因素水平和正交试验结果见表2、表3。

3结果与分析

本研究选用碱液浸提的方法，初步探究了氢氧化钠溶液

提取率（%）11 113.61021224.20231333.81942124.11252234.52462313.98273134.07283214.32193324.242k111.63111.79411.913k212.61813.04712.556k312.63512.04312.415极差R1.004 1.2530.643主次顺序B>A>C优水平A2 B2C3优组合A2B2C3

浓度、料液比、浸提时间3个因素对程海螺旋藻多糖提取率的影响。通过单因素试验和正交试验对比发现，3个因素对程海螺旋藻中多糖提取率均有影响，影响程度依次为：B（料液比）>A（提取液浓度）>C（提取时间）。以多糖提取率为考察指标，最优试验条件组合为A2B2C3，氢氧化钠溶液浓度为0.4 mol/L、料液比为1 g ∶25 mL、浸提时间为2 h，程海螺旋藻中多糖提取率为4.524%。

曲阜师范大学的研究人员报道了极大螺旋藻中多糖的提取率为3.935%[8]；南京中医药大学的研究人员报道了盐泽螺旋藻中多糖的提取率约为27%[9]。对比发现，钝顶螺旋藻和极大螺旋藻的多糖含量低，但相差不大，而盐泽螺旋藻的多糖含量相对较高。

参考文献：

[1]孙远征，张学成，纪雷. 钝顶螺旋藻多糖提取工艺的研究——三氯乙酸（TCA）法的正交试验优化[J]. 海洋科学，2007，31（4）：42-47.

[2]陆杰. 浅谈螺旋藻[J]. 医药化工，2008（9）：33-36.

[3]冯婷，何聪芬，赵华，等. 植物多糖研究概况[J]. 北京工商大学学报：自然科学版，2004，22（5）：1-4.

[4]张文雄，覃海错，黄文榜，等. 螺旋藻粗多糖提取工艺研究[J]. 广西化工，1999，28（1）：13-16.

[5]夏冰，郭育涛. 螺旋藻多糖粗提方法的工艺条件研究[J]. 安徽农学通报，2010，16（11）：40-41，92.

[6]高宪军，段涛，王承明. 碱提棉籽粕多糖工艺研究[J]. 食品工业科技，2010，31（11）：258-261.

[7]贲永光，钟红茂，李康，等. 超声辅助提取螺旋藻多糖的试验研究[J]. 中成药，2011，33（6）：1078-1080.

[8]孙鹏. 极大螺旋藻多糖提取方法研究[J]. 科技情报开发与经济，2011，21（11）：184-186.

[9]于光，马宇翔. 盐泽螺旋藻多糖的最佳获取条件[J]. 中国农学通报，2010，26（23）：108-111.吕兴萍，杨薇红，马春娇. 响应面优化酶法提取灵芝多糖工艺条件[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：258-260.endprint

蒽酮-硫酸反应：取几滴螺旋藻提取液于试管中，用胶头滴管滴加3～5滴蒽酮溶液，混合摇匀后再滴加3～5滴浓硫酸，观察试验现象。

α-萘酚-硫酸反应：取几滴螺旋藻提取液于试管中，用胶头滴管滴加3～5滴α-萘酚溶液，混合摇匀后再滴加3～5滴浓硫酸，观察试验现象。

将螺旋藻提取液多糖定性试验结果列于表1。螺旋藻提取液反应试验结果均与多糖类化合物显色反应试验结果相同，证明螺旋藻提取液中含多糖类化合物。

螺旋藻提取液多糖定性试验结果

试剂苯酚-硫酸蒽酮-硫酸α-萘酚-硫酸现象溶液颜色由无

色变成橙红色溶液颜色呈墨

绿色有紫红色环产生

2.4单因素试验结果与分析

2.4.1氢氧化钠浓度对多糖提取率的影响用电子天平准确称取2.000 0 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，分别用30 mL不同浓度的氢氧化钠溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）浸提2 h，过滤，将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸发浓缩至10 mL，待其冷却至室温，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振荡5 min使其混合均匀，再静置5 h（除蛋白质），将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，静置过夜（进行醇沉），以4 000 r/min离心10 min，弃上清液，依次用无水乙醇、丙酮洗剂沉淀数次，将洗剂后的沉淀在烧杯中溶解并转移至100 mL容量瓶中定容，测其吸光度，计算提取液中多糖的提取率。氢氧化钠浓度对多糖提取率影响结果如图3所示。

开始阶段，随着提取液氢氧化钠溶液浓度的增加，多糖提取率也不断增加，当氢氧化钠溶液浓度超过0.4 mol/L，多糖提取率开始降低。碱液浸提有助于破坏细胞壁聚合物分子的结构，从而提高多糖提取率，但碱液浓度过高则与多糖类化合物发生脱酯反应和消去反应从而破坏多糖结构，根据试验结果，最终确定0. 4mol/L为较佳的氢氧化钠提取液浓度。

2.4.2料液比对多糖提取率的影响用电子天平准确称取2.0000 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，固定提取液氢氧化钠溶液的浓度为0.4 mol/L，调变料液比分别为1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL，碱液浸提2 h，过滤，将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸发浓缩至10 mL，待其冷却至室温，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振荡5 min，再静置5 h（除蛋白质），将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液，加入 80 mL 95%乙醇，静置过夜（进行醇沉），以4 000 r/min离心10 min弃去上清液，依次用无水乙醇、丙酮洗剂沉淀数次，将洗剂后的沉淀在烧杯中溶解并转移至100 mL容量瓶中定容，测其吸光度，计算提取液中多糖的提取率。料液比对螺旋藻多糖提取率的影响结果如图4所示。

开始阶段，随着料液比的增加，多糖提取率也不断增加，当料液比超过1 g ∶25 mL后，多糖提取率开始降低。料液比越大，螺旋藻细胞壁作为半透膜两侧多糖浓度差越大，有利于多糖浸出，但料液比太大，使得多糖在蒸发浓缩过程中损失加剧，从而降低多糖提取率。综合考虑，选取1 g ∶25 mL为多糖提取的较佳料液比。

2.4.3浸提时间对多糖提取率的影响用电子天平准确称取2.0000g干燥至恒重的螺旋藻粉末，用50mL浓度为

0.4 mol/L 的氢氧化钠溶液分别浸提0.5、1、1.5、2、2.5 h，过滤，将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸发浓缩至10 mL，待其冷却至室温加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，振荡5 min，再静置5 h（除蛋白质），将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，静置过夜（进行醇沉），以 4 000 r/min 离心10 min弃去上清液，依次用无水乙醇、丙酮洗剂沉淀数次，将洗剂后的沉淀在烧杯中溶解并转移至 100 mL 容量瓶定容，测其吸光度，计算提取液中多糖的提取率。浸提时间对螺旋藻多糖提取率的影响结果见图5。

浸提时间延长，多糖提取率也逐渐增加，当浸提时间超过1.5 h后，多糖提取率开始降低。原因可能是随着浸提时间的延长，部分多糖降解为可溶于乙醇的单糖、寡糖或低聚糖，在醇沉过程中溶解损失，导致多糖提取率降低。综上试验，选取1.5 h为螺旋藻中多糖提取的较佳浸提时间。

2.5正交试验结果与分析

在单因素试验的基础上，以氢氧化钠溶液浓度、料液比、浸提时间为变量，多糖提取率为考察指标，考察这3个变量因素对多糖提取率的影响。设计3因素3水平的正交试验，因素水平和正交试验结果见表2、表3。

3结果与分析

本研究选用碱液浸提的方法，初步探究了氢氧化钠溶液

提取率（%）11 113.61021224.20231333.81942124.11252234.52462313.98273134.07283214.32193324.242k111.63111.79411.913k212.61813.04712.556k312.63512.04312.415极差R1.004 1.2530.643主次顺序B>A>C优水平A2 B2C3优组合A2B2C3

浓度、料液比、浸提时间3个因素对程海螺旋藻多糖提取率的影响。通过单因素试验和正交试验对比发现，3个因素对程海螺旋藻中多糖提取率均有影响，影响程度依次为：B（料液比）>A（提取液浓度）>C（提取时间）。以多糖提取率为考察指标，最优试验条件组合为A2B2C3，氢氧化钠溶液浓度为0.4 mol/L、料液比为1 g ∶25 mL、浸提时间为2 h，程海螺旋藻中多糖提取率为4.524%。

曲阜师范大学的研究人员报道了极大螺旋藻中多糖的提取率为3.935%[8]；南京中医药大学的研究人员报道了盐泽螺旋藻中多糖的提取率约为27%[9]。对比发现，钝顶螺旋藻和极大螺旋藻的多糖含量低，但相差不大，而盐泽螺旋藻的多糖含量相对较高。

参考文献：

[1]孙远征，张学成，纪雷. 钝顶螺旋藻多糖提取工艺的研究——三氯乙酸（TCA）法的正交试验优化[J]. 海洋科学，2007，31（4）：42-47.

[2]陆杰. 浅谈螺旋藻[J]. 医药化工，2008（9）：33-36.

[3]冯婷，何聪芬，赵华，等. 植物多糖研究概况[J]. 北京工商大学学报：自然科学版，2004，22（5）：1-4.

[4]张文雄，覃海错，黄文榜，等. 螺旋藻粗多糖提取工艺研究[J]. 广西化工，1999，28（1）：13-16.

[5]夏冰，郭育涛. 螺旋藻多糖粗提方法的工艺条件研究[J]. 安徽农学通报，2010，16（11）：40-41，92.

[6]高宪军，段涛，王承明. 碱提棉籽粕多糖工艺研究[J]. 食品工业科技，2010，31（11）：258-261.

[7]贲永光，钟红茂，李康，等. 超声辅助提取螺旋藻多糖的试验研究[J]. 中成药，2011，33（6）：1078-1080.

[8]孙鹏. 极大螺旋藻多糖提取方法研究[J]. 科技情报开发与经济，2011，21（11）：184-186.

[9]于光，马宇翔. 盐泽螺旋藻多糖的最佳获取条件[J]. 中国农学通报，2010，26（23）：108-111.吕兴萍，杨薇红，马春娇. 响应面优化酶法提取灵芝多糖工艺条件[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：258-260.endprint

蒽酮-硫酸反应：取几滴螺旋藻提取液于试管中，用胶头滴管滴加3～5滴蒽酮溶液，混合摇匀后再滴加3～5滴浓硫酸，观察试验现象。

α-萘酚-硫酸反应：取几滴螺旋藻提取液于试管中，用胶头滴管滴加3～5滴α-萘酚溶液，混合摇匀后再滴加3～5滴浓硫酸，观察试验现象。

将螺旋藻提取液多糖定性试验结果列于表1。螺旋藻提取液反应试验结果均与多糖类化合物显色反应试验结果相同，证明螺旋藻提取液中含多糖类化合物。

螺旋藻提取液多糖定性试验结果

试剂苯酚-硫酸蒽酮-硫酸α-萘酚-硫酸现象溶液颜色由无

色变成橙红色溶液颜色呈墨

绿色有紫红色环产生

2.4单因素试验结果与分析

2.4.1氢氧化钠浓度对多糖提取率的影响用电子天平准确称取2.000 0 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，分别用30 mL不同浓度的氢氧化钠溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）浸提2 h，过滤，将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸发浓缩至10 mL，待其冷却至室温，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振荡5 min使其混合均匀，再静置5 h（除蛋白质），将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，静置过夜（进行醇沉），以4 000 r/min离心10 min，弃上清液，依次用无水乙醇、丙酮洗剂沉淀数次，将洗剂后的沉淀在烧杯中溶解并转移至100 mL容量瓶中定容，测其吸光度，计算提取液中多糖的提取率。氢氧化钠浓度对多糖提取率影响结果如图3所示。

开始阶段，随着提取液氢氧化钠溶液浓度的增加，多糖提取率也不断增加，当氢氧化钠溶液浓度超过0.4 mol/L，多糖提取率开始降低。碱液浸提有助于破坏细胞壁聚合物分子的结构，从而提高多糖提取率，但碱液浓度过高则与多糖类化合物发生脱酯反应和消去反应从而破坏多糖结构，根据试验结果，最终确定0. 4mol/L为较佳的氢氧化钠提取液浓度。

2.4.2料液比对多糖提取率的影响用电子天平准确称取2.0000 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，固定提取液氢氧化钠溶液的浓度为0.4 mol/L，调变料液比分别为1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL，碱液浸提2 h，过滤，将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸发浓缩至10 mL，待其冷却至室温，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振荡5 min，再静置5 h（除蛋白质），将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液，加入 80 mL 95%乙醇，静置过夜（进行醇沉），以4 000 r/min离心10 min弃去上清液，依次用无水乙醇、丙酮洗剂沉淀数次，将洗剂后的沉淀在烧杯中溶解并转移至100 mL容量瓶中定容，测其吸光度，计算提取液中多糖的提取率。料液比对螺旋藻多糖提取率的影响结果如图4所示。

开始阶段，随着料液比的增加，多糖提取率也不断增加，当料液比超过1 g ∶25 mL后，多糖提取率开始降低。料液比越大，螺旋藻细胞壁作为半透膜两侧多糖浓度差越大，有利于多糖浸出，但料液比太大，使得多糖在蒸发浓缩过程中损失加剧，从而降低多糖提取率。综合考虑，选取1 g ∶25 mL为多糖提取的较佳料液比。

2.4.3浸提时间对多糖提取率的影响用电子天平准确称取2.0000g干燥至恒重的螺旋藻粉末，用50mL浓度为

0.4 mol/L 的氢氧化钠溶液分别浸提0.5、1、1.5、2、2.5 h，过滤，将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸发浓缩至10 mL，待其冷却至室温加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，振荡5 min，再静置5 h（除蛋白质），将滤液置于离心机中以4 000 r/min离心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，静置过夜（进行醇沉），以 4 000 r/min 离心10 min弃去上清液，依次用无水乙醇、丙酮洗剂沉淀数次，将洗剂后的沉淀在烧杯中溶解并转移至 100 mL 容量瓶定容，测其吸光度，计算提取液中多糖的提取率。浸提时间对螺旋藻多糖提取率的影响结果见图5。

浸提时间延长，多糖提取率也逐渐增加，当浸提时间超过1.5 h后，多糖提取率开始降低。原因可能是随着浸提时间的延长，部分多糖降解为可溶于乙醇的单糖、寡糖或低聚糖，在醇沉过程中溶解损失，导致多糖提取率降低。综上试验，选取1.5 h为螺旋藻中多糖提取的较佳浸提时间。

2.5正交试验结果与分析

在单因素试验的基础上，以氢氧化钠溶液浓度、料液比、浸提时间为变量，多糖提取率为考察指标，考察这3个变量因素对多糖提取率的影响。设计3因素3水平的正交试验，因素水平和正交试验结果见表2、表3。

3结果与分析

本研究选用碱液浸提的方法，初步探究了氢氧化钠溶液

提取率（%）11 113.61021224.20231333.81942124.11252234.52462313.98273134.07283214.32193324.242k111.63111.79411.913k212.61813.04712.556k312.63512.04312.415极差R1.004 1.2530.643主次顺序B>A>C优水平A2 B2C3优组合A2B2C3

浓度、料液比、浸提时间3个因素对程海螺旋藻多糖提取率的影响。通过单因素试验和正交试验对比发现，3个因素对程海螺旋藻中多糖提取率均有影响，影响程度依次为：B（料液比）>A（提取液浓度）>C（提取时间）。以多糖提取率为考察指标，最优试验条件组合为A2B2C3，氢氧化钠溶液浓度为0.4 mol/L、料液比为1 g ∶25 mL、浸提时间为2 h，程海螺旋藻中多糖提取率为4.524%。

曲阜师范大学的研究人员报道了极大螺旋藻中多糖的提取率为3.935%[8]；南京中医药大学的研究人员报道了盐泽螺旋藻中多糖的提取率约为27%[9]。对比发现，钝顶螺旋藻和极大螺旋藻的多糖含量低，但相差不大，而盐泽螺旋藻的多糖含量相对较高。

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