影响油棕叶片愈伤组织诱导因素研究

邹积鑫　尤丽莉　林位夫

摘 要 研究不同取材部位、激素组合配比等因素对3个不同油棕品系叶片愈伤组织培养的影响。结果表明：不同部位的油棕叶片以及不同品系的油棕愈伤组织诱导存在极显著差异；试验以MS培养基+5 mg/L 2，4-D+10 mg/L TDZ+6 g/L琼脂+30 g/L糖配比获得较好的愈伤诱导率；添加2%活性炭可以有效抑制油棕叶片愈伤组织褐化。

关键词 油棕 ；叶片 ；愈伤组织

分类号 S564+.6

Some Factors Affecting Callus Induction from Oil Palm Leaves

ZOU Jixin1） YOU Lili2） LIN Weifu1）

（1 Rubber Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737；

2 Hainan University， Haikou， Hainan 570228）

Abstract Different parts of leaves and hormone combinations involved in oil palm leave callus culture for three strains of oil palm were studied. The result indicated that different parts of leaves and different strains of oil palm have significant difference in callus induction. The optimum medium components for oil palm callus induction were Murashige-Skoog （MS） medium supplemented with 5 mg·L-12，4-D and 10 mg/L TDZ and 6 g/L agar and 30 g/L sucrose. The supplying of 2% charcoal can prevent explants from browning efficiently.

Keywords oil palm ；leaves ； callus

油棕（Elaeis guineensis Jacg.）为棕榈科（Palmae）油棕属（Elaeis）常绿高大乔木，原产于热带非洲，是世界最重要的木本油料作物，被誉为“世界油王”，广泛栽培于南纬10°至北纬15°之间的热带地区，是世界第一大木本油料作物。近年来，随着油棕组织培养技术的不断深入开展，油棕的组培苗表现出良好的产量和品质性状，与常规种子繁育的油棕品系相比具有明显的竞争优势，逐渐被认可和应用，是世界油棕种苗产业未来发展的新方向[1]。国外的油棕组织培养技术研究开始较早也比较深入，1970年Staritsky[2]和Rabechault等[3]首次通过油棕种子胚获得了油棕再生植株；1976年Rabechault等[4]通过油棕叶片获得再生植株。目前在马来西亚、印度尼西亚、哥斯达黎加等国家已经有油棕组织苗的商业化生产[5-7]。由于油棕组织培养技术难度大又具有较高的商业价值，该技术已成为商业机密，极少公开报道。国内龚峥等[8]于1987年开展了油棕组织培养的研究，分别以叶片和种胚诱导获得油棕愈伤组织，但未见获得完整油棕植株的报道。油棕叶片的初代诱导启动比较慢、愈伤组织诱导率较低、重复性较差。为建立高效的油棕组织培养体系，本研究以油棕叶片为外植体材料，探讨了叶片的不同位置、不同品系、基本培养基和激素的不同配比等因素对油棕愈伤组织诱导的影响，成功获得高质量的油棕愈伤组织，为建立高效油棕组织培养体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料采自中国热带农业科学院橡胶研究所油棕种质圃树龄约10年的油棕单株，包括RYL2、RYL4、RYL6三种油棕品系单株。

1.2 方法

1.2.1 材料前处理

选择连续1周内天气晴朗的日子采集油棕叶片。取材前将油棕树一侧的叶片清理干净，在油棕生长点上方用铲刀将油棕芯部取下，剥除外侧叶柄并用75%的酒精对表面进行消毒处理，充分干燥之后将其装入干燥封闭的容器内，运回实验室备用。

1.2.2 油棕外植体叶片的消毒处理

将采集得到的外植体材料用洗衣粉清洗表面，再用大量的自来水冲洗30 min，接着用75%的酒精擦洗外部及两端切口，置于超净工作台上，再用75%酒精擦洗2 min后，剥去次外层，依照此方法层层消毒后留取芯部较嫩的叶片供接种。先用接种刀将叶片切分成8～10 cm的小段，再将叶片小段切分成1 cm×2 cm的薄片备用。

1.2.3 不同部位的油棕叶片对愈伤组织诱导的影响

以油棕茎干切面中心点为起点，沿螺旋方向标记不同部位的油棕叶片，最中心的叶片标记为0号，依次标记0～12号，将不同编号的叶片分别接种到MS+5mg/L 2，4-D +10 mg/L TDZ+6 g/L琼脂+30 g/L糖的培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养温度为（28±1）℃。每6～7 d观察1次，每2个月继代1次，培养12个月后统计愈伤组织诱导情况。每处理50瓶材料，重复3次。

1.2.4 不同品系油棕叶片对愈伤组织诱导的影响

选取RYL2、RYL4、RYL6三个油棕品系各1株，采集油棕嫩叶，选择生理状态较为一致的油棕叶片接种到愈伤组织诱导培养基中。本试验采用正交试验设计方法，以MS为基本培养基附加如下不同浓度激素的2，4-D，NAA，TDZ，各处理编号依次为OPC1～OPC9，具体情况详见表1。endprint

以上培养均在暗培养条件下进行，培养温度为（28±1）℃，每隔6～7 d进行观察记录，每2个月继代培养，培养12个月后统计油棕叶片愈伤组织的诱导情况，每处理50瓶材料，重复3次。

1.2.5 不同浓度的植物生长调节剂组合对诱导油棕愈伤组织的影响

选择生理状态较一致的油棕叶片，接种到愈伤组织诱导培养基中。本试验设计为基本培养基MS附加一定浓度的2，4-D、NAA、TDZ，其中2，4-D浓度水平分别为2、5、10、20 mg/L，NAA浓度水平分别为1、5、10、15 mg/L，TDZ浓度水平分别为2、5、10、20 mg/L，实验共设计24个处理，编号依次为OPC3 1～OPC3 24。以上培养在暗培养条件下进行，培养温度为（28±1）℃，每隔6～7 d进行观察记录，每2个月继代培养，培养12个月后统计油棕叶片愈伤组织的诱导情况，每处理50瓶材料，重复3次。

1.2.6 活性炭、抗坏血酸对油棕愈伤组织诱导培养中褐化的影响

在配方为MS+5 mg/L 2，4-D +10 mg/L TDZ+30 g/L糖的基础上分别添加不同浓度的活性炭、抗坏血酸，将油棕叶片接种到不同处理的培养基上，其中添加活性炭为0.1%，0.2%，0.5%三个水平，编号OPM4 1，OPM4 2，OPM4 3；添加抗坏血酸为0.1%，0.2%，0.5%三个水平，编号OPM4 4，OPM4 5，OPM4 6，培养条件为暗培养，温度为（28±1）℃，每5 d观察记录，2个月后统计褐变情况。

2 结果与分析

2.1 不同部位的油棕叶片对油棕愈伤组织诱导的影响

不同部位的油棕叶片愈伤组织出愈率见表2。从表2可以看出，不同部位的油棕叶片愈伤组织出愈率在1.33%～24.67%，最高的部位在7号区域，最低的部位在12号区域。试验结果表明，编号为3～9区域的叶片最适合愈伤组织培养，不同部位的油棕叶片由于其生理状况不同，而导致愈伤组织诱导的情况存在明显的差异，通过DPS软件统计分析其p值=1.87×10-11<0.01，差异极显著。

2.2 不同品系油棕叶片对愈伤组织诱导的影响

表3的试验结果表明，不同品系油棕愈伤组织诱导率，在不同种类和浓度的植物外源激素诱导条件下存在差异，其中诱导率最高的是处理OPC2，达到28.67%，最低的是处理OPC4和处理OPC8，为3.33%。通过DPS软件进行极差分析，结果表明，TDZ在3个水平、4个因素中极差最大，是主要影响因素，NAA排第二，2，4-D排第三，相对于激素的种类和浓度来说，品系是最小的影响因子，这说明影响不同品系油棕愈伤组织诱导最主要的因素是所采用的激素类型。

2.3 不同浓度的植物生长调节剂组合对诱导油棕愈伤组织的影响

从表4可以看出，随着植物外源激素含量的增加，油棕叶片愈伤组织诱导率呈不断提高的趋势，但过高的激素浓度组合会降低油棕愈伤组织诱导率。其中最高的诱导率为23号组合，即5 mg/L 2，4-D与10 mg/L TDZ的配比，获得油棕愈伤组织出愈率为46.00%；最低为6号组合，出愈率为5.33%。在试验设置的浓度配比中，在其中1种激素一定的情况下，另1种不同浓度激素处理间存在极显著差异，p值在（0.002～1.5）×10-6<0.01，但是在2，4-D浓度为5 mg/L时，不同浓度的TDZ处理间p值=0.015>0.01，存在显著差异，因此2，4-D在该浓度下可能对油棕愈伤组织诱导的作用较为明显。从表4还可以看出，在植物激素不断提高的情况下，虽然总愈伤组织的诱导率提高，但胚性愈伤组织的诱导率降低，非胚性的愈伤组织增多。在试验中也可以观察到，过高的植物激素使油棕的愈伤组织根化，出现了一些不正常的形态，如图1～3所示。

2.4 活性炭、抗坏血酸对油棕愈伤组织诱导培养中褐化的影响

根据表5的试验结果，在油棕叶片愈伤组织诱导培养基中，添加一定浓度的活性炭可有效降低培养物的褐变程度（图4）。当添加1%的活性炭时，愈伤组织褐化程度明显低于对照处理和添加抗坏血酸的处理，1%、2%、5%三个处理间对抑制褐变的效果差别不大。同时添加活性炭处理的愈伤组织诱导率要高于添加抗坏血酸处理以及对照的，说明活性炭有助于油棕愈伤组织的诱导。

3 讨论与结论

3.1 外植体材料对油棕愈伤组织诱导的影响

油棕组织培养的研究始于20世纪70年代，关于油棕外植体材料的选择，国内外均进行了大量的研究。Wahid等[9]分别利用油棕的种胚、根、叶、花成功获得了油棕愈伤组织，但目前运用最广泛的也是商业化程度最高的仍然是采用油棕的嫩叶作为外植体材料[10]。因为首先，所采用的油棕叶片被包裹在油棕茎干里面，基本上是无菌的，消毒非常容易；其次，叶片属于植物的体细胞，通过叶片细胞诱导愈伤组织获得再生植株，可以完全遗传亲本的性状，后代不会变异；第三，油棕叶片采集比较方便，1～2年即可恢复生长，可以多次利用。

利用油棕体细胞进行愈伤组织诱导与利用种子胚诱导相比是非常困难的，这是因为种子胚中细胞的分化程度远小于体细胞，加上叶片的不同位置其生理状态不同，叶片的分化程度也不一致，这也直接决定了其愈伤组织诱导成功的比例。

3.2 外源激素对油棕愈伤组织诱导的影响

植物激素是影响植物组织培养成功与否的一个关键因素，这主要是由于植物激素在植物组织培养中的累积现象及后效作用而影响下代分化，通常以很低的浓度就可以产生很大的作用，但在油棕初代培养阶段，所采用的植物激素浓度较其他植物的培养高出很多倍，这可能是由于油棕体细胞本身对某些植物激素的响应程度较低造成的，也是油棕体细胞愈伤组织诱导的一个特点。但是较高的浓度，也会存在后代变异的风险。有报道指出，油棕组培后代在开花和结果时，会出现一定比例的变异情况，造成油棕的减产[11]，可能是由于油棕初代诱导时过高的激素浓度造成的。因此，在油棕愈伤组织诱导阶段，植物外源激素种类和浓度的选择，值得深入探讨和研究。国内外在油棕愈伤组织诱导阶段采用的激素种类很多，包括2，4-D，NAA，TCPP，Di等。本研究使用了TDZ、2，4-D和NAA 3种植物激素进行研究，这3种激素在作用效果上表现为TDZ>2，4-D>NAA，效果好的植物激素其所需浓度相对较低，培养的结果也比较理想，但关于培养后期对油棕组培苗变异程度的影响还有待进一步的观察。endprint

3.3 活性炭对油棕愈伤组织诱导的影响

褐化是组培过程中外植体内的酚类物质在有氧气的条件下，被多酚氧化酶氧化形成有毒的醌类物质，聚合形成黑褐色物质扩散到培养基中，使外植体切面迅速变成褐色，抑制其他酶的活性，对外植体产生毒害的现象。在木本植物组织培养中褐化现象更为普遍，由于油棕叶片内酚类物质含量及多酚氧化酶活性较高，因此容易发生褐化现象，对试验影响较大。本研究通过添加活性炭和抗坏血酸等物质，有效地降低了外植体的褐化现象。

活性炭不仅能够吸附有毒物质，同时也能吸附其他物质。从试验的结果可知，在油棕愈伤组织诱导形成中，不仅产生多酚等物质，同时还有其他未知的代谢产物可能影响油棕愈伤组织的诱导，因此活性炭非褐变率和诱导率都高于抗坏血酸。但是过高的活性炭，在高温下会水解培养基中的蔗糖，使培养基pH改变，导致培养基不凝固。因此选用2%的添加浓度比较理想。

参考文献

[1] Soh A C， Wong G， Tang C C， et al. Recent advances towards commercial production of elite oil palm clones， Palm Oil Congr.， 2001[C]. Kuala Lumpur： Malaysian Palm Oil Board， 2001.

[2] Staritsky G. Tissue culture of oil palm （Elaeis guineensis JACQ.） as a tool for its vegetative propagation[J]. Ephytica， 1970， 19（3）： 288-292.

[3] Rabechault H， Guenin G， Ahee J. Colonies cellulaires et formes embryoides obtenues in vitro a patir de cultures d'embryons de palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.var.dura Becc.）[J]. CRAcad Sci Paris， 1970， 270： 3 067-3 070.

[4] Rabéchault H， Martin J P. Multiplication végétative du palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.） a l'aide de cultures de tissus folaires[J]. CRAcad Sci Paris， 1976， 283（16）： 1 735-1 737.

[5] Khaw C H， Ng S K. Performance of commercial scale clonal oil palm（Elaeis guineensis Jacq.）planting in Malaysia， September 29～October 3， 1997[C]. Brisbane： Int Soc Hort Sci Symp， 1997.

[6] Duval Y， Amblard P， Rival A， et al. Progress in oil palm tissue culture and clonal performancein Indonesia and the Co^te d'Ivoire[C]//Proceeding of international planters conference， Kuala Lumpur， Malaysia， 1997： 291-307

[7] Guzman N， Peralta F. Advances in tissue culture propagation of compact Oil palm clones in Costa Rica[J]. ASD Oil palm Papers， 2010， 35： 1-12.

[8] 龚 峥， 崔元方， 陈幸华， 等. 油棕叶片愈伤组织endprint

3.3 活性炭对油棕愈伤组织诱导的影响

褐化是组培过程中外植体内的酚类物质在有氧气的条件下，被多酚氧化酶氧化形成有毒的醌类物质，聚合形成黑褐色物质扩散到培养基中，使外植体切面迅速变成褐色，抑制其他酶的活性，对外植体产生毒害的现象。在木本植物组织培养中褐化现象更为普遍，由于油棕叶片内酚类物质含量及多酚氧化酶活性较高，因此容易发生褐化现象，对试验影响较大。本研究通过添加活性炭和抗坏血酸等物质，有效地降低了外植体的褐化现象。

活性炭不仅能够吸附有毒物质，同时也能吸附其他物质。从试验的结果可知，在油棕愈伤组织诱导形成中，不仅产生多酚等物质，同时还有其他未知的代谢产物可能影响油棕愈伤组织的诱导，因此活性炭非褐变率和诱导率都高于抗坏血酸。但是过高的活性炭，在高温下会水解培养基中的蔗糖，使培养基pH改变，导致培养基不凝固。因此选用2%的添加浓度比较理想。

参考文献

[1] Soh A C， Wong G， Tang C C， et al. Recent advances towards commercial production of elite oil palm clones， Palm Oil Congr.， 2001[C]. Kuala Lumpur： Malaysian Palm Oil Board， 2001.

[2] Staritsky G. Tissue culture of oil palm （Elaeis guineensis JACQ.） as a tool for its vegetative propagation[J]. Ephytica， 1970， 19（3）： 288-292.

[3] Rabechault H， Guenin G， Ahee J. Colonies cellulaires et formes embryoides obtenues in vitro a patir de cultures d'embryons de palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.var.dura Becc.）[J]. CRAcad Sci Paris， 1970， 270： 3 067-3 070.

[4] Rabéchault H， Martin J P. Multiplication végétative du palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.） a l'aide de cultures de tissus folaires[J]. CRAcad Sci Paris， 1976， 283（16）： 1 735-1 737.

[5] Khaw C H， Ng S K. Performance of commercial scale clonal oil palm（Elaeis guineensis Jacq.）planting in Malaysia， September 29～October 3， 1997[C]. Brisbane： Int Soc Hort Sci Symp， 1997.

[6] Duval Y， Amblard P， Rival A， et al. Progress in oil palm tissue culture and clonal performancein Indonesia and the Co^te d'Ivoire[C]//Proceeding of international planters conference， Kuala Lumpur， Malaysia， 1997： 291-307

[7] Guzman N， Peralta F. Advances in tissue culture propagation of compact Oil palm clones in Costa Rica[J]. ASD Oil palm Papers， 2010， 35： 1-12.

[8] 龚 峥， 崔元方， 陈幸华， 等. 油棕叶片愈伤组织endprint

3.3 活性炭对油棕愈伤组织诱导的影响

褐化是组培过程中外植体内的酚类物质在有氧气的条件下，被多酚氧化酶氧化形成有毒的醌类物质，聚合形成黑褐色物质扩散到培养基中，使外植体切面迅速变成褐色，抑制其他酶的活性，对外植体产生毒害的现象。在木本植物组织培养中褐化现象更为普遍，由于油棕叶片内酚类物质含量及多酚氧化酶活性较高，因此容易发生褐化现象，对试验影响较大。本研究通过添加活性炭和抗坏血酸等物质，有效地降低了外植体的褐化现象。

活性炭不仅能够吸附有毒物质，同时也能吸附其他物质。从试验的结果可知，在油棕愈伤组织诱导形成中，不仅产生多酚等物质，同时还有其他未知的代谢产物可能影响油棕愈伤组织的诱导，因此活性炭非褐变率和诱导率都高于抗坏血酸。但是过高的活性炭，在高温下会水解培养基中的蔗糖，使培养基pH改变，导致培养基不凝固。因此选用2%的添加浓度比较理想。

参考文献

[1] Soh A C， Wong G， Tang C C， et al. Recent advances towards commercial production of elite oil palm clones， Palm Oil Congr.， 2001[C]. Kuala Lumpur： Malaysian Palm Oil Board， 2001.

[2] Staritsky G. Tissue culture of oil palm （Elaeis guineensis JACQ.） as a tool for its vegetative propagation[J]. Ephytica， 1970， 19（3）： 288-292.

[3] Rabechault H， Guenin G， Ahee J. Colonies cellulaires et formes embryoides obtenues in vitro a patir de cultures d'embryons de palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.var.dura Becc.）[J]. CRAcad Sci Paris， 1970， 270： 3 067-3 070.

[4] Rabéchault H， Martin J P. Multiplication végétative du palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.） a l'aide de cultures de tissus folaires[J]. CRAcad Sci Paris， 1976， 283（16）： 1 735-1 737.

[5] Khaw C H， Ng S K. Performance of commercial scale clonal oil palm（Elaeis guineensis Jacq.）planting in Malaysia， September 29～October 3， 1997[C]. Brisbane： Int Soc Hort Sci Symp， 1997.

[6] Duval Y， Amblard P， Rival A， et al. Progress in oil palm tissue culture and clonal performancein Indonesia and the Co^te d'Ivoire[C]//Proceeding of international planters conference， Kuala Lumpur， Malaysia， 1997： 291-307

[7] Guzman N， Peralta F. Advances in tissue culture propagation of compact Oil palm clones in Costa Rica[J]. ASD Oil palm Papers， 2010， 35： 1-12.

[8] 龚 峥， 崔元方， 陈幸华， 等. 油棕叶片愈伤组织endprint