月桂挥发油体外抗病原微生物活性研究

王城城,蒲静,金家贵,胡杰,代娟,代敏(.成都医学院检验医学院,成都 60500；2.成都医学院第一附属医院,成都 60500)

·论 著·

月桂挥发油体外抗病原微生物活性研究

王城城1,蒲静2*,金家贵1,胡杰1,代娟1,代敏1
(1.成都医学院检验医学院,成都 610500；2.成都医学院第一附属医院,成都 610500)

目的 探讨月桂挥发油对临床分离细菌和真菌的体外抗菌活性,为月桂在治疗感染性疾病中的开发与运用奠定基础。方法 采用琼脂平板二倍稀释法测定了月桂挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌共16种65株临床分离细菌、14株白假丝酵母和1株非白假丝酵母临床分离真菌的最低抑菌浓度。用SPSS 17.0软件中单因素方差分析法比较分析了月桂挥发油分别对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、洛菲不动杆菌和白假丝酵母菌共5个不同种属细菌和真菌抑菌活性的强弱。结果 月桂挥发油除对铜绿假单胞菌无明显抗菌活性外,对其余受试细菌均有较强的抗菌活性,MIC为0.27 mg/mL～2.15 mg/mL；月桂挥发油对白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌均有较强的抗菌活性,MIC分别为0.07～0.54 mg/mL和0.03 mg/mL；月桂挥发油对白假丝酵母菌和洛菲不动杆菌的抑菌活性明显强于对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌活性(P<0.01),对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的抑菌活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 月桂挥发油有较强的抗细菌和抗真菌活性,具有用于防治感染性疾病-新型抗菌药物的开发和运用前景。

月桂；挥发油；抗细菌活性；抗真菌活性

抗生素的发展和运用曾使感染性疾病得到有效控制,但随之而来的细菌耐药性[1,2]给广大国内外科技工作者提出了更大挑战,积极开发新的抗菌药物及从天然药物中寻找“抗生素替代品”等研究成了目前国内外的研究热点和难点[3-5]。中药作为祖国医学的宝贵遗产,具有独特的资源优势,且毒副作用小、不易产生抗药性[6],更多学者将目标投向了抗菌中药的研究。月桂(LaurusnobilisL.)是一种芳香类植物,原产于地中海地区,现我国山东、四川、陕西、江苏、浙江、福建及云南等省均有栽培,其挥发油中主要含有α-乙酸松油酯、肉桂醛、1,8-桉叶素、β-桉叶油醇、β-石竹烯、丁香酚甲醚等成分,常用于调味品、医药、化妆品和化工等领域[7,8]。现代药理研究[7,9-11]表明,月桂具有抗炎、抗氧化、降低血糖、抗菌等药理活性,可治疗头痛、偏头痛、胃溃疡、感染性疾病等。

目前,对于月桂的研究相对较少,其抗菌活性研究主要集中于月桂挥发油在食品防腐保鲜中的运用,即对食品中食源性腐败菌和致病菌的抑制作用[11-13]；鲜有月桂中分离单体成分的抗菌作用研究[14-15]。本研究以临床分离细菌和真菌为研究对象,研究月桂挥发油体外抗临床分离菌的活性,为月桂挥发油在治疗细菌和真菌感染性疾病方面提供科学依据,亦为抗感染性疾病传统中药的新药研发和综合利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药物

月桂挥发油,购自上海香汇生物科技有限公司,密度为1.03 g/mL。

1.2 菌种

1.2.1 标准株 1)细菌：大肠埃希菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923,四川抗菌素工业研究所赠送；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC43300,购自美国临床实验室标准化协会(CLSI)；大肠埃希菌标准株CMCC(B)44102和金黄色葡萄球菌标准株CMCC(B)26003,购自四川省药检所。2)白假丝酵母菌：CICC1284购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2.2 临床分离株 1)细菌：革兰阳性菌4种18株(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌、类白喉杆菌),革兰阴性菌12种47株(大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、沙门菌、支气管败血鲍特菌、洛菲不动杆菌、卡他莫拉菌、产酸克雷伯菌、黏质沙雷菌、阴沟肠杆菌和弗劳地枸橼酸杆菌),分离于四川省妇幼保健院妇科门诊患者,并经SIMENS公司的MICROSCAN鉴定板条鉴定,菌株种类和株数(见表1)。2)真菌：14株白假丝酵母菌和1株非白假丝酵母菌,分离于四川省妇幼保健院妇科门诊患者的上呼吸道和阴道等部位,并经BIO-KONT公司的KC-16鉴定板条与药敏纸片鉴定。

1.3 培养基、试剂及耗材

Mueller-Hinton agar(OXOID)、沙氏琼脂培养基(含氯霉素0.1 g/L,广东环凯微生物科技有限公司),营养琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司),一次性无菌培养皿(江苏康健生物有限公司)等。

1.4 主要仪器

多点接种仪(SAKUMA MIT-P型),VITEK DENSICHEK,上海申安立式自动电热压力蒸汽灭菌器(LDZX-40SBI),CO2INCUBATOR(MOC-15A),节能净化工作台(成都新光非兰特净化工程有限公司)。

1.5 实验方法

采用琼脂平板二倍稀释法分别测定了药物对细菌和真菌的体外抑菌活性。具体方法参考美国临床实验室标准化协会(CLSI)抗微生物药物敏感性试验执行标准。

1.5.1 含药平板制备 采用倍比稀释法用1%吐温-80溶液对药物进行稀释,分别将药物稀释成1︰2,1︰4,1︰8,1︰16,1︰32,1︰64,1︰128,1︰256,1︰512,1︰1 024共10个梯度,在一次性无菌培养皿中分别加入不同浓度梯度的稀释药液1 mL和14 mL灭菌的MH培养基,充分混匀,使药物在平板中的浓度为1/30,1/60,1/120,1/240,1/480,1/960,1/1 920,1/3 840,1/7 680,1/15 360,平板自然干燥后备用。以平板内分别用无菌蒸馏水和1%吐温-80溶液1 mL代替药物制备阳性对照和溶剂对照平板。

1.5.2 菌液配置 将各标准株和临床分离株用无菌生理盐水调至菌液浓度1.5×106CFU/mL。

1.5.3 最低抑菌浓度(MIC)测定及结果判定 采用多点接种仪将菌液加入不同浓度梯度的含药平板和阳性对照平板,并以生理盐水代替菌液作阴性对照。37 ℃恒温培养18～24 h,观察各菌株在含不同浓度梯度药物平板中的生长情况。以无细菌生长平板内药物的最小浓度为挥发油对该菌株的MIC。

1.6 统计学方法

对含4株以上的同种属菌株,分别统计其抑制50%和90%菌株的MIC,即MIC50和MIC90；用SPSS 17.0软件中的单因素方差分析法比较分析月桂挥发油对不同种属菌株抑菌活性的强弱,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 月桂挥发油的抗细菌活性

本实验采用琼脂平板二倍稀释法测定了月桂挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等16种细菌的MIC。月桂挥发油除对铜绿假单胞菌无明显抗菌活性外,对其余受试菌株均有较强的抗菌活性,对耐药菌株和敏感株有相同的抑菌活性,MIC为0.27 mg/mL～2.15 mg/mL,其中对肠球菌和嗜麦芽假单胞菌的抑菌活性相对较强,MIC为0.27 mg/mL(见表1)。

表1 月桂挥发油的MIC

n指受试菌株数,“-”表示月桂挥发油在平板中最大浓度(34.33 mg/mL)时无抗菌活性。临床分离菌株中,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌2株,产AmpC酶大肠埃希菌2株,产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)大肠埃希菌5株

2.2 月桂挥发油的体外抗真菌活性

采用琼脂平板2倍稀释法测定了月桂挥发油对白假丝酵母菌和非白假丝酵母菌2种真菌的MIC。月桂挥发油对白假丝酵母菌标准株与14株临床分离株均有较强抗菌活性,MIC分别为0.27 mg/mL和0.07～0.54 mg/mL；对非白假丝酵母菌临床分离株亦有较强的抗菌活性,MIC为0.03 mg/mL(见表2)。

表2 月桂挥发油体外抗真菌活性

n指受试菌株数,2株白假丝酵母菌临床分离株对克霉唑耐药

2.3 月桂挥发油对不同种类病原微生物的抑菌活性比较分析

采用SPSS软件的单因素方差分析法比较分析了月桂挥发油对含有4株以上受试菌种的抑菌活性强弱,并分析其MIC50和MIC90。月桂挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的抑菌活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)；对白假丝酵母菌和洛菲不动杆菌的抑菌活性明显强于对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌活性(P<0.01)(见表3)。

与月桂挥发油对金黄色葡萄球菌的MIC比较,﹡﹡P<0.01,与月桂挥发油对大肠埃希菌的MIC比较,★★P<0.01

3 讨论

植物香料不仅具有调味作用,还具有一定的抗菌活性。国内外学者研究发现,芳香类植物精油具有明显抗菌活性,具有潜在的天然食品防腐剂开发和利用价值。月桂为中国常见树种,具有很好的观赏价值,同时也作为香料广泛运用于食品、化妆品和化工等领域。

目前关于月桂的研究主要集中于月桂挥发油化学成分和抗菌活性的研究,因地理环境和提取方法的差异,化学成分亦不尽相同。对于其抗菌活性的研究,国外主要侧重于月桂挥发油在食品防腐保鲜的作用,如月桂挥发油对面包、胡萝卜肉汤等食品储藏过程中蜡样芽胞杆菌、李斯特氏菌、大肠埃希菌、恶臭假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、空肠弯曲菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉、啤酒酵母、柠檬形克勒克酵母、白假丝酵母菌等食源性腐败菌和致病菌的抑制作用[7,13,16]。此外,对于月桂提取物和单体鲜有报道,Ramos等[7]报道,月桂水提物和醇提物无明显抗菌作用,有明显抗氧化作用；富饶等[14]报道,月桂酸对番茄叶霉菌菌丝均具有不同程度的抑制作用；徐雨[15]报道,从月桂叶提取物分离的2种类黄酮活性成分,即山奈酚-3-O-α-L-(2″,4″-di-E-p-香豆酰基)-鼠李糖苷和山奈酚-3-O-α-L-(2″-di-E-p-香豆酰基,4″-Z-p-香豆酰基)-鼠李糖苷对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌都表现出抗菌活性。

目前尚未见有关月桂挥发油抗临床病原微生物的活性研究报道,本研究分析了月桂挥发油对临床分离病原性细菌和真菌的抗菌活性。结果表明,月桂挥发油除对临床分离的铜绿假单胞菌无明显抗菌活性外,对临床分离4种革兰阳性菌和11种革兰阴性菌均有明显抗菌活性,MIC为0.27 mg/mL～2.15 mg/mL；对临床分离的白假丝酵母菌以及非白假丝酵母真菌具有较强的抗菌活性,MIC为0.03～0.54 mg/mL。此外,本研究首次将单因素方差分析运用于月桂挥发油对不同种类病原微生物抗菌活性强弱的比较,分析了月桂挥发油对19株金黄色葡萄球菌、27株大肠埃希菌、6株肺炎克雷伯菌、4株洛菲不动杆菌和15株白假丝酵母真菌的抗菌活性强弱。结果表明,月桂挥发油对白假丝酵母真菌MIC (0.19±0.12)mg/mL的抗菌活性强于对细菌的抗菌活性,其中与革兰阴性大肠埃希菌MIC(1.25±0.68)mg/mL和革兰阳性金黄色葡萄球菌MIC(1.14±0.74)mg/mL的抑菌活性比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。比较月桂挥发油对不同种类细菌抑菌活性时发现,月桂挥发油除对洛菲不动杆菌的抑菌活性明显强于对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌外(P<0.01),对其它革兰阳性菌与革兰阴性菌的抑菌活性比较,差异无统计学意义。比较分析月桂挥发油对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的MIC均值、MIC50和MIC90时发现,月桂挥发油对金黄色葡萄球菌的抑菌活性相对强于对大肠埃希菌的抑菌活性。由此提示,月桂挥发油具有广谱的抗病原微生物活性,具有运用于细菌和真菌所致感染性疾病的开发和运用前景。

面对愈演愈烈的全球细菌性耐药难题,加强天然抗菌药物的开发与利用成为目前科技工作者的重大攻关课题之一。为探讨月桂挥发油对耐药菌株和敏感菌株抑菌活性的差异,本研究受试菌中的标准株和临床分离株既包含了敏感株,也包含了耐药株,如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的标准株ATCC43300和临床分离株,以及产氨苄青酶和超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌等多重耐药菌株。结果发现,月桂挥发油对敏感株和耐药株的抗菌活性差异无统计学意义,说明月桂挥发油在治疗各类感染性疾病,尤其是多重耐药菌株引起的感染性疾病具有明显优势,这在控制细菌耐药性难题方面亦具有重要的理论和现实意义。

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Antimicrobial Activity of the Essential Oil from Laurel

WANGCheng-cheng1,PUJing2*,JINJia-gui1,HUJie1,DAIJuan1,DAIMin1

(1.SchoolofLaboratoryMedicine,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China;2.TheFirstAffiliatedHospital,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China)

Objective To investigate the antimicrobial activity of the essential oil from laurel, to lay the foundations for development and application of laurel in treating infectious diseases. Methods Minimum inhibitory concentrations (MICs) of the essential oil of laurel against 65 strains of bacteria, 14 strains of Candida albicans and 1 strain of non-Candida albicans were determined by agar dilution method. The data were analyzed using statistical software SPSS 17.0, and multifactor analysis of variance (ANOVA) was used to compare the differences between different microorganisms. Results The essential oil from laurel had no effect on Pseudomonas aeruginosa, and the laurel oil showed different antibacterial activity to different species of other experimental bacteria, with MICs ranging from 0.27 mg/mL to 2.15 mg/mL. The laurel oil had strong activity against Candida albicans and non-Candida albicans, with MICs 0.07-0.54 mg/mL, 0.03 mg/mL, respectively. The laurel oil had higher activity against Candida albicans than S. aureus and E. coli (P<0.01), and the oil had higher activity against Acinetobacter lwoffii than S. aureus and E. coli (P<0.01). Conclusion The essential oil from laurel showed broad-spectrum antimicrobial activity so to make it a potential candidate as antimicrobial agent to treat infectious diseases.

Laurel; Essential Oil; In Vitro Antibacterial Activity; In Vitro Antifungal Activity

四川省卫生厅项目(NO：130307)；四川省教育厅项目(NO：11ZB206)；成都医学院大学生创新性实验项目(NO：CX201209)；成都医学院校基金(NO:CYZ11-002)。

蒲静,E-mail:yabaobaolin2012@163.com

10.3969/j.issn.1674-2257.2014.02.005

R285.5

A