心肌梗死后小鼠心肌Bax和Bcl-2的表达

程琳，夏豪

论著·基础

心肌梗死后小鼠心肌Bax和Bcl-2的表达

程琳，夏豪

目的研究心肌梗死后小鼠心脏中Bax和Bcl-2的表达。方法雄性C57BL/6小鼠40只随机分为2组：对照组(10只)和实验组(30只)，实验组结扎冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型，对照组仅在冠状动脉前降支处穿过缝线，不做结扎。术后4周对2组小鼠进行心肌取材，Western blot方法检测Bax和Bcl-2蛋白在心脏表达的差异。结果实验组小鼠术后4周存活率为53.3%(16/30)，对照组为100%(10/10)。Bax和Bcl-2在对照组心肌均有表达，在实验组小鼠心脏远离梗死区(N)、心肌梗死周边区(B)、梗死区(I)的表达逐渐增加(P<0.05)，且B区、I区Bax/Bcl-2比值高于N区及对照组(P<0.05)。结论Bax和Bcl-2在心肌梗死后心脏中呈高表达，且Bax/Bcl-2比值在心肌梗死区及周边区显著增加，提示凋亡可能在心肌梗死后心脏重构中发挥重要作用。

心肌梗死;凋亡;Bax;Bcl-2；小鼠

心肌梗死后心脏重构包括心肌细胞凋亡、肥大、坏死及心肌基质胶原纤维合成和降解的动态平衡。近年来凋亡在心肌梗死后心脏重构中的作用受到广泛关注[1，2]，Bax和Bcl-2是凋亡的重要调控因子，二者如何调控心肌细胞凋亡的发生以及凋亡发生的机制仍有待进一步研究。现建立小鼠心肌梗死模型并检测Bax和Bcl-2在心肌梗死后心脏各区域的表达差异，探讨其在心肌梗死后心脏重构中的重要作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物为C57BL/6遗传背景的野生型雄性小鼠(C57)40只，SPF级，体质量23～28 g，8～9周龄，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。随机分为对照组10只，实验组30只，一抗购自美国Cell Signaling Technology 公司，包括Bax(2772)、Bcl-2(2870)、GAPDH (2118)；二抗包括Goat anti-Rabbit IRD 800CW(92632211，Li-Cor)和Goat anti-Mouse IRD 800CW(92632210，Li-Cor)。其他实验材料包括BCA蛋白定量试剂盒(23225，Thermo), PVDF膜(ISEQ00010，Millipore)、预染彩色蛋白质低分子量Marker(SM0671，Fermentas)等。

1.2 实验方法

1.2.1 制备心肌梗死模型： 参考国内动物模型制备相关文献建立小鼠心肌梗死模型[3～5]。实验组小鼠采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，左侧胸部手术区备皮后消毒，加热垫上插管并连接小动物呼吸机，沿3～4肋间水平切开皮肤，逐层分离肌肉及软组织，暴露心脏，在肺动脉圆锥与左心耳之间距离主动脉根部1 mm处结扎前降支。此时观察到缝线下方区域变白、局部心肌运动减弱后逐层缝合胸壁。对照组仅穿缝线不结扎，其余处理方法同实验组。待小鼠恢复自主呼吸后拔除通气导管，置于加热垫上继续观察，动物清醒后更换新饲养笼，添加饲料和饮水后送回饲养室。

1.2.2 取材： 术后小鼠自由进食和饮水，每天观察并记录小鼠状态及存活情况。如发现动物死亡，查明原因。术后4周心脏标本取材，需迅速将其置于10%KCl溶液中，轻柔挤去心腔内残余血液，待心脏停跳于舒张期后迅速切除心房及右心室，对照组左心室纵向对称取材分为2部分，实验组左心室根据梗死范围分为3部分取材：远离梗死区(N)、周边区(B)及心肌梗死区(I)，取材后迅速置于液氮中暂时保存后转移至-80℃冰箱保存。

1.3 检测指标 小鼠心脏组织中Bax 和Bcl-2蛋白的表达：-80℃冰箱取出小鼠心脏组织，裂解液提取组织蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，浓度经校正后取等量蛋白用自制10%SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，处理后与相应一抗4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜后室温避光孵育二抗1 h，荧光显色后以Quality One软件 (version 4.6.2,Bio-Rad)半定量分析荧光强度。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 存活率 实验组小鼠术后4周存活率为53.3%(16/30)，小鼠死亡主要集中在术后第1周，一旦死亡立即进行解剖，可见小鼠胸腔大量血块及心肌梗死区心尖部破裂口。对照组小鼠术后4周存活率100%(10/10)。

2.2 Bax和Bcl-2蛋白表达 Western blot(免疫印迹法)分析对照组和实验组手术后4周Bax和Bcl-2蛋白的表达，以GAPDH为内参，结果见图1；结果分析显示：Bax、Bcl-2在对照组均有表达，在实验组小鼠心脏N区、B区及I区表达均逐渐增加(P<0.05)；I区、B区Bax/Bcl-2比值显著高于N区和对照组小鼠心脏(P<0.05)，见图2。

图1 2组小鼠术后4周心脏中Bax和Bcl-2的表达

注：与对照组比较，aP<0.05；与N区比较，bP<0.05；与B区比较，cP<0.05

图2 2组小鼠术后4周心脏不同区域Bax和Bcl-2的表达

3 讨 论

心肌梗死是临床常见的威胁人类健康和生命的疾病，急性心肌梗死后左室重构介导的心力衰竭和恶性心律失常更是导致恶性心脏事件发生和死亡的主要原因。随着显微外科技术的发展和人们对小鼠模型优越性的认识，如易于饲养、繁殖力强、周期短及其调节心脏血管发育的基因、信号通路与人类相似性强等，越来越多的国内外研究采用小鼠进行心肌梗死方面的实验研究，通过建立小鼠心脏疾病动物模型可帮助阐明该疾病的机制[6～8]。

目前常用的心肌梗死造模方法主要有冠状动脉前降支结扎法和大剂量异丙基肾上腺素诱发等方法[9，10]，冠状动脉结扎法通过闭塞冠状动脉引起心肌梗死，可以最大限度模拟临床心肌梗死过程。固定的结扎部位是稳定的心肌梗死模型的前提，实验组术中2只小鼠结扎后缝线下方区域未见变白，可能与冠状动脉的生理变异等原因有关。小鼠心肌梗死后4周存活率为53.3%，心脏破裂是主要的早期并发症和致死原因。心尖部心室壁较薄，供血终端区的坏死程度显著，侧支循环少，心肌收缩对无活动力并僵硬的坏死区产生的剪力效应等都是引起心脏破裂的局部因素[11]。

长期以来人们认为凝固性坏死是心肌细胞的主要死亡方式，近期许多研究表明更多的心肌细胞是死于凋亡，部分心肌细胞由于能量缺乏可从凋亡转向坏死。凋亡是心肌梗死面积大小的主要决定因素，心肌细胞凋亡的持续存在扩大了梗死面积，使心肌进行性丢失，梗死范围延展，室壁变薄，心室扩张，心脏重构逐渐发生发展为心力衰竭。心肌梗死后心肌各区域凋亡的不同表现成为目前研究的热点[12，13]，梗死周边区心肌细胞的凋亡可能与梗死范围的延展有关。

细胞凋亡是机体细胞在生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程，它的发生受到机体的严密调控。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡的重要调控因子，它定位于细胞内膜系统，主要存在于线粒体外膜、核膜和内质网，是一种原癌基因。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最主要的抑制凋亡和促进凋亡蛋白，二者单独具有调控细胞凋亡的功能，还可以形成同源二聚体及异源二聚体，二者相互拮抗共同调节着细胞凋亡。

本研究发现Bax、Bcl-2在对照组小鼠和实验组小鼠心脏远离梗死区、周边区及心肌梗死区表达逐渐增加；Bax/Bcl-2比值在实验组心脏周边区及心肌梗死区表达显著高于对照组心脏和实验组心脏远离梗死区。证实了Bax 和Bcl-2 在心肌梗死后心脏中呈高表达，且Bax/Bcl-2比值在心肌梗死周边区显著增加，提示凋亡在晚期心肌梗死后心脏重构中发挥重要作用。

1 Liu ZH,Yang D,Xie P,et al. MiR-106b and MiR-15b modulate apoptosis and angiogenesis in myocardial infarction[J]. Cell Physiol Biochem, 2012, 29(5/6): 851-862.

2 Nef HM,Möllmann H, Hilpert P, et al. Activated cell survival cascade protects cardiomyocytes from cell death in Tako-Tsubo cardiomyopathy[J]. Eur J Heart Fail, 2009, 11(8): 758-764.

3 尉新华，范慧敏，李铁岩，等．小鼠心肌梗死模型的建立和无创评价方法[J]．同济大学学报:医学版，2011，32(5)：20-22, 35．

4 张浩，侯迈，胡盛寿．小鼠心肌梗死模型的建立和无创超声评价[J]．中国微创外科杂志，2007，7(11)：1111-1112．

5 赵晓辉，周健，马瑞彦，等．建立小鼠心肌梗死模型的研究[J]．四川动物，2006，25(3)：627-629, 封4．

6 Li HL,Tang QZ,Liu C,et al. Cellular FLICE-inhibitory protein protects against cardiac remodeling induced by angiotensin II in mice[J]. Hypertension, 2010, 56(6): 1109-1117.

7 Mostarda C, Rodrigues B, Vane M, et al. Autonomic impairment after myocardial infarction: role in cardiac remodelling and mortality[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010, 37(4): 447-452.

8 Xiao JF,Moon M, Yan L,et al.Cellular FLICE-inhibitory protein protects against cardiac remodelling after myocardial infarction[J]. Basic Res Cardiol, 2012, 107(1): 239.

9 Korkmaz S, Radovits T, Barnucz E, et al. Pharmacological activation of soluble guanylate cyclase protects the heart against ischemic injury[J]. Circulation, 2009, 120(8): 677-686.

10 Liu B,Li WM,Li Y,et al. Protective effects of N-acetylcysteine in isoproterenol-induced myocardium injury in rats[J]. Mol Biol Rep, 2009, 36(4): 761-765.

11 Birnbaum Y, Chamoun AJ,Anzuini A, et al. Ventricular free wall rupture following acute myocardial infarction[J]. Coron Artery Dis, 2003, 14(6): 463-470.

12 Arakawa M, Yasutake M, Miyamoto M, et al. Transduction of anti-cell death protein FNK protects isolated rat hearts from myocardial infarction induced by ischemia/reperfusion[J]. Life Sci, 2007, 80(22): 2076-2084.

13 Lazou A,Iliodromitis EK,Cieslak D,et al.Ischemic but not mechanical preconditioning attenuates ischemia/reperfusion induced myocardial apo-ptosis in anaesthetized rabbits:the role of Bcl-2 family proteins and ERK1/2[J]. Apoptosis, 2006, 11(12): 2195-2204.

ExpressionofBaxandBcl-2inmicewithmyocardialinfarction

CHENGLin,XIAHao.

DepartmentofCardiology,WuhanUniversityAffiliatedTianyouHospital,Wuhan, 431000,China

XIAHao,E-mail:xiahao1966@163.com

ObjectiveTo determine the expression of apoptotic protein Bax and Bcl-2 in heart of mice after myocardial infarction.MethodsForty male C57BL/6 mice were randomly divided into 2 groups: the control group (10 rats) and experimental group (30 rats), in the experimental group, left anterior descending coronary artery was ligated to establish the model of myocardial infarction, in the control group, no ligation were performed in the anterior descending coronary artery. After 4 weeks, the 2 groups of mice's myocardial material were taken, western blot method were used for detection of Bax and Bcl-2 protein expression differences in the heart.Results4 weeks after operation, the survival rate of mice in the experimental group was 53.3% (16/30), the control group was 100% (10/10). Bax and Bcl-2 in the control group had the expression,in the experimental group,expression increased gradually in area far from myocardial infarcted (N),the surrounding area of myocardial infarction (B), infarction area (I) (P<0.05), and the B zone, I zone Bax/Bcl-2 ratio is higher than that of N and control group (P<0.05).ConclusionThe high expression of Bax and Bcl-2 in heart after myocardial infarction may suggest that apoptosis plays an important role in later period of cardiac reconstruction after myocardial infarction.

Myocardial infarction; Apoptosis; Bax; Bcl-2;Mice

国家自然科学基金面上项目(No.81270184)

430060 武汉科技大学附属天佑医院心血管内科(程琳)； 武汉大学人民医院心血管内科(夏豪)

夏豪，E-mail:xiahao1966@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.09.017

2013-02-28)