AMPK/mTOR信号通路在DIO与DR大鼠胰腺中的表达

韩 洁， 杨 慧，杜建颖， 王春妹， 王启明 ，田德润

(天津医科大学 解剖与组织胚胎学系，天津 300070)

mTOR(mammalian target of rapamycin)，即哺乳动物雷帕霉素靶点，在所有的真核生物中普遍高表达，是调节细胞生长的中心，与人类的健康息息相关，许多慢性疾病的发生都与mTOR通路信号的改变有关，如II型糖尿病、肥胖、代谢综合征以及多种肿瘤性疾病[1-3]。mTOR存在于两种复合体中，mTORC1和mTORC2[4]。其中，mTORC1由四个亚基组成，其下游底物包括4E-BP1和S6K等；而mTORC2由五个亚基组成，包括其下游底物包括AKT、PKC等。两种复合体中，mTORC1与代谢联系紧密[5]，它可以控制细胞生长，血管发生和代谢等[6- 7]。mTOR通路上游有多种调节因素，如：瘦素(leptin)、脂联素、胃饥饿素(ghrelin)、胆囊收缩素、胰岛素等，这些因素可以在下丘脑和外周器官通过mTOR通路相互影响以调控机体的能量平衡[8]。下丘脑是机体能量调节的中枢，而胰腺作为一个重要的外周器官，对能量平衡和代谢也有重要的影响。我们前期的实验发现食源性肥胖(DIO)大鼠下丘脑AMPK表达下调，导致mTOR通路活性增加。本文旨在比较DIO大鼠和DR大鼠胰腺中mTOR通路的变化，并探讨这种变化对整个机体能量和代谢过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 100只刚断乳雄性SD大鼠，体重40～50 g。动物饲养于天津医科大学实验动物中心，动物室温度：(22±2)℃；每天光照：7：00～19:00；随意取食饲料和自来水。基础维持饲料适应喂养1周后分组：①高脂饮食组(n=80)，给予自制高脂饮食饲料；②对照组(n=20)，继续给予基础维持饲料。继续喂养14周后，高脂饮食组体重超过对照组最大体重者，设为肥胖组(DIO)；体重低于对照组平均体重的设为肥胖抵抗组(DR)。

1.2 动物饲料 基础维持饲料能量成份：5%脂肪，55%碳水化合物，22%蛋白质，7%灰分，5%纤维素。饲料热量为3.80 kcal/g。

自制高能饲料配方为：50%标准动物饲料，15%猪油，10%白糖，5%奶粉，10%鸡蛋，5%芝麻油，5%花生。能量成份为：30%脂肪，40%碳水化合物，15.5%蛋白质，4%灰分，3%纤维素。饲料热量为4.76 kcal/g。

1.3 取材 各组动物经水合氯醛(500 mg/kg)麻醉后，主动脉插管，用生理盐水快速灌注冲出血液后，用4%多聚甲醛缓慢灌注，至全身肌肉抽搐后停止。迅速剪开腹腔，取胰腺，放入4 ℃4%多聚甲醛溶液中后固定，过夜。

1.4 包埋及切片 部分组织梯度蔗糖脱水(至组织下沉)后，用OCT胶包埋。冰冻切片厚度：6～8 μm。其余组织蒸馏水冲洗后，经梯度酒精脱水、二甲苯透明，石蜡包埋。石蜡切片厚度：4 μm。

1.5 免疫组织化学和免疫荧光

1.5.1 免疫组织化学 石蜡切片经二甲苯和梯度酒精脱蜡至水，0.3% H2O2甲醇溶液灭活过氧化物酶，98℃柠檬酸钠修复抗原，10%山羊血清封闭后，加入一抗(AMPK、4E-BP1)，4℃过夜，再经SP试剂盒(二抗和辣根过氧化物酶)，DAB显色，苏木素染色，酒精梯度脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片。PBS替代一抗作为阴性对照。

1.5.2 免疫荧光 冰冻切片经室温复温后水化，经1%Triton-X100增加通透性，10%山羊血清封闭后，加入一抗(S6K)，4℃过夜，再避光加入二抗、DAPI，最后用甘油封片。PBS替代一抗作为阴性对照。用倒置荧光显微镜(Olympus IX71)观察并照相；通过比较荧光信号的强弱和荧光细胞的数量对结果进行分析。

1.6 图像分析 针对各组的免疫组化染色结果，分别选取5个独立的视野用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测量出单位光密度值，并求得平均光密度值(OD值)再进行比较分析。

2 结果

2.1 动物模型结果 初始体重高脂饮食组(49.95±2.56)g，对照组(48.65±2.94)g，两组无差别。给予不同饲料4周后开始出现差别，持续到14周。两组最终体重分别为高脂饮食组(545.98±49.49)g，对照组(497.55±37.38)g，具有显著差异(P<0.001)(见图1)。其中，高脂饮食组36只大鼠体重超过对照组最高体重，设置成DIO组(587.56±39.32)g，11只鼠体重低于对照组平均体重，设置成DR组(476.90±15.06)g，对照组体重取中间10只，设置成CO组(503.03±17.24)g。DIO组与DR组、DIO组与CO组之间体重有统计意义(P<0.001)，DR组和CO组之间体重无统计意义(见图2)。

注：﹡：P<0.05，﹡﹡：P<0.01,﹡﹡﹡:P<0.001,VS对照组。图1 大鼠体重变化图

注：﹡﹡﹡:P<0.001,vs DR；﹟﹟﹟：P<0.001,vsCO。图2 分组后大鼠体重图

2.2 免疫组织化学和免疫荧光结果 AMPK在胰腺中的阳性表达以胞浆为主，呈棕黄色颗粒状；以内分泌部细胞表达明显。DIO组明显高于DR组，有统计意义(P<0.05)(见表1、图3)。

表1大鼠胰腺各组免疫组化结果平均光密度值(OD值)比较

注：﹡：P<0.05，vs DIO。

4E-BP1阳性表达同样以胞浆为主，呈棕黄色颗粒状，表达的区域以胰腺的外分泌部细胞最为明显，胰岛外周部亦有表达，DIO组明显低于DR组，有统计学意义(P<0.05)(见表1、图4)。

S6K的免疫荧光阳性表达着色以胞浆为主，呈绿色荧光，胰腺的胰岛外周部有典型的绿色荧光信号，DIO组明显低于DR组(见图5)。

注： A:DIO胰腺；B:DR胰腺。图4 4E-BP1免疫组织化学染色SP法×100

注： A:DIO胰腺；B:DR胰腺。图5 S6K免疫荧光×200

图6 AMPK/mTOR通路图

3 讨论

肥胖及其相关性代谢性疾病在世界的流行越来越受到人们的关注。食源性肥胖大鼠模型的建立过程，模拟了人类肥胖发生的过程。在建模过程中，原本体重无差异的大鼠，部分表现出摄食过度，成为DIO大鼠，另外的部分则维持了相对正常的体重，成为DR大鼠，这表明肥胖这种疾病的发生受基因和环境(如饮食)共同控制，而不是仅受基因或者环境单方面的影响。

果蝇和哺乳动物基因研究表明TSC1/TSC2是位于mTORC1上游的重要抑制剂，磷酸化TSC1/TSC2可以调节mTORC1的活性，缺失TSC1/TSC2会导致mTORC1过度活跃[9]。 AMPK可以磷酸化TSC2保守的丝氨酸位点，抑制mTORC1复合体的活性[10]。而当缺乏TSC2的细胞时给予AMPK后，细胞仍然可以变现出部分抑制，说明AMPK还可以通过除TSC2之外的其他途径直接或间接影响mTORC1活性[11]，如AMPK可以通过直接磷酸化raptor(mTORC1复合体的一个亚基)来抑制mTOR通路的活性[12-13]。

AMPK是一种AMP相关的高度保守的异源三聚体丝氨酸/苏氨酸激酶复合体。AMPK可以作为机体能量的开关，在能量不足的情况下被激活[9]。当能量不足时，AMP可以直接绑定AMPKγ亚基的CBS区域，抑制α亚基的丝氨酸的去磷酸化，而这种丝氨酸的磷酸化是AMPK激活所必须的[14]。AMPK可以对中枢神经系统和外周组织中的激素和营养的信号作出反应，进而调节食物摄入和能量消耗。其下游靶点mTOR通路，可以作为细胞内的营养传感器来调节蛋白质合成、细胞生长和代谢。

mTOR通路经典的下游靶标4E-BP1和S6K都有一个特殊的基序(TOS基序)，可以使二者直接绑定到mTORC1复合体的raptor上[15]。4E-BP1多个位点磷酸化，使得4E-BP1从eIF4E上解离，并促进eIF4G与eIF4E绑定，最终形成翻译起始复合物。同时，S6K1的389位苏氨酸磷酸化，激活S6K1，随后磷酸化核糖体蛋白S6，最终促进蛋白质的合成。另外，S6K1也可以对准eIF4B的422位丝氨酸，促进其与eIF4A绑定，提高eIF4A解链酶活性，然后启动蛋白质翻译过程[16](见图6)。

胰腺作为机体重要的内分泌器官，分为外分泌部和内分泌部。其中内分泌部起主要作用的是胰岛细胞，包括α细胞、β细胞、D细胞和PP细胞等。α细胞主要位于胰岛的外周部分，分泌胰高血糖素；β细胞和D细胞主要位于胰岛的中间部分，分别分泌胰岛素和生长激素；而PP细胞含量很少，分泌胰多肽。

我们的结果显示，DR大鼠胰岛的周围部分4E-BP1和S6K表达增加，也就是mTOR通路活性与DIO相比明显增加，而其上游AMPK信号却相对减弱。而位于胰岛外周的是胰岛α细胞[17]，信号活化增加了胰高血糖素的分泌。胰高血糖素可以激活肝细胞的磷酸化酶，加速糖原分解。也可激活脂肪酶，促进脂肪分解，并且加强脂肪酸氧化，使酮体生成增多。还可以促进氨基酸进入肝细胞。酮体和氨基酸的增加可以促进糖异生，可以与分解的肝糖原共同升高血糖。升高的血糖可以通过下丘脑的AMPK传递饱食的营养信号，刺激下丘脑弓状核分泌抑制食欲的POMC[18]，导致食物的摄入的减少，从而使DR大鼠维持较正常体重。此外，胰高血糖素在肝脏促进脂肪分解，也可以从另一方面维持DR大鼠体重。有文献报道，胰岛α细胞缺失的胰岛对葡萄糖刺激产生的胰岛素明显降低[19]，也就是说，胰高血糖素刺激了胰岛素的分泌，缺乏其刺激作用将减少胰岛素的分泌，这可能是DR大鼠能维持正常体重的又一重要原因。但确切的机制需要进一步的研究证实。

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