GRP78在胃癌生长中的作用*

付政祺， 镇鸿燕， 刘丽江△

(江汉大学 1医学院病理学与病理生理学教研室, 2江大病理诊断所， 湖北 武汉 430056)

葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78，GRP78), 又称免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin binding protein，BiP)，是参与蛋白质折叠和组装的重要内质网分子伴侣[1]。正常(非应激)状态下，GRP78与横跨内质网膜上的蛋白(PERK、IRE-1、ATF6)相结合，抑制其活性。当各种因素，如细胞营养物质缺乏、蛋白质翻译后修饰障碍、钙平衡失调、病毒感染以及氧化应激等，所致的细胞内环境发生紊乱时，GRP78与跨膜蛋白相解离，通过与未折叠/错误折叠蛋白相结合，促进蛋白质的折叠能力及其阻止错误折叠/未折叠蛋白的释出，对细胞发挥保护作用[2]。最近发现：GRP78在多种恶性肿瘤中表达上调[3-4]。

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤的第二位[5]。近年来的研究发现，相对于非肿瘤黏膜，人体胃癌组织细胞胞浆中内质网分子伴侣GRP78和GRP94(与GRP78同属热休克蛋白70家族成员)的表达明显升高，且与肿瘤大小、浸润深度和淋巴结转移等相关[6-7]。在胃癌裸鼠移植瘤模型中，敲除GRP78可抑制体外肿瘤细胞的侵袭力，及移植瘤的生长与转移[8]，提示GRP78可能是促进胃癌细胞增殖、存活及转移的重要分子。为进一步明确GRP78在胃癌细胞生长中的作用，本研究对人胃癌组织中GRP78的表达情况进行检测, 观察其与临床病理参数(胃癌浸润深度、淋巴结转移程度等)的关系; 其次, 通过建立过表达GRP78的重组胃癌细胞模型SGC7901-H78，观察生长相关蛋白cyclin D1表达量的改变，以进一步明确GRP78在胃癌细胞生长中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1标本来源 收集江汉大学附属医院2009～2010年胃腺癌根治性手术切除并有完整病理学检查数据的标本34例，及癌旁组织(肿瘤旁1 cm处)和正常组织(远离肿瘤≥10 cm处)34例。所有病例术前均未进行放疗和化疗。

1.2细胞 人胃癌细胞株SGC7901由华中科技大学同济医学院免疫学系惠赠，稳定高表达GRP78细胞株由上海吉玛制药技术有限公司构建与鉴定。

1.3主要试剂 小牛血清购自Gibco；GRP78抗体购自Abcam；cyclin D1和β-actin抗体购自Santa Cruz；BCA蛋白测定试剂盒购自Pierce；SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

2 主要方法

2.1细胞培养 胃癌细胞株SGC7901和SGC7901-H78(过表达GRP78的SGC7901)用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基(Gibco), 置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每2～3 d传代1次。

2.2免疫组织化学染色[7]所有染色均经DAB显色。 GRP78检测以癌组织细胞质内呈棕黄色表达为阳性。 操作过程严格按照说明书要求进行。

2.3Western blotting检测[9]将胃癌组织、癌旁组织、正常组织匀浆收集，SGC7901细胞和SGC7901-H78细胞收集后，BCA法测蛋白，进行SDS-PAGE电泳, 电泳后湿转至PVDF膜, 含5%脱脂奶粉的TBS-T(含0.05% Tween-20的TBS)37 ℃封闭60 min, 加1∶1 000稀释的抗GRP78和抗cyclin D1蛋白的多克隆抗体4 ℃孵育过夜。 TBS-T漂洗5 min×3次, 加入1∶4 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG， 37 ℃孵育45 min。 TBS-T漂洗5 min×3次, ECL化学发光试剂检测。

3 统计学处理

SPSS 13.0统计学软件处理, 数据用均数±标准差(mean±SD)表示，相关因素分析采用Spearman等级相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 胃癌组织中GRP78的表达

免疫组织化学检测发现, GRP78在人体胃癌组织细胞的胞浆中高表达, GRP78阳性率为73.5% (25/34)，见图1和表1。 Western blotting检测发现, 人体胃癌组织中GRP78的表达水平明显高于癌旁组织(肿瘤旁1 cm范围内)和正常组织，见图2。

Figure 1. Immunohistochemical staining of GRP78 in gastric cancer tissues (×400). A: adjacent non-malignant tissues; B: high differentiation; C: intermediate differentiation; D: low differentiation.

2 胃癌组织中GRP78的表达与临床病理参数之间的关系

全组34例胃癌, 男26例, 女8例。 年龄42～69岁, 中位年龄56.7岁。 免疫组织化学检测发现, 人体胃癌组织中GRP78表达水平明显高于癌旁组织和正常组织，且与性别、分化程度相关，见图1和表1。

表1 胃癌组织中GRP78的表达与临床病理参数之间的关系

Figure 2. Western blotting analysis of GRP78 expression in specimens of gastric adenocarcinoma tumour tissues (T), adjacent non-malignant tissues (A) and corresponding normal tissues (N).

3 人胃癌细胞SGC7901和SGC7901-H78中GRP78和生长相关蛋白cyclin D1的表达改变

Western blotting检测发现, 相对于SGC7901细胞，SGC7901-H78细胞(稳定过表达GRP78的SGC7901)中GRP78蛋白的表达明显升高；同时检测生长相关蛋白cyclin D1的表达发现，随着GRP78表达的上调，cyclin D1蛋白表达增加，见图3。

Figure 3. Western blotting analysis of GRP78 and cyclin D1 expression in gastric cancer SGC7901 cells and SGC7901-H78 cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs SGC7901.

讨 论

GRP78是内质网内的重要分子伴侣，参与蛋白质的折叠、加工、转运等[1]。虽然在主要的成熟器官中GRP78的表达都维持在低基础水平，但在多种恶性肿瘤，如乳腺癌、胃癌、肺癌等中，GRP78的表达明显上调，并随着恶性程度的升高而升高[4, 7]。在转移癌细胞株和淋巴结转移灶中GRP78表达增高，而敲除 GRP78可抑制体外瘤细胞侵袭力，并且可抑制异种移植瘤的生长和转移。在肿瘤细胞的微环境下，GRP78的高表达可以减少肿瘤细胞的凋亡，有利于肿瘤细胞的生长和转移[10-11]。

本研究在人体胃癌组织中发现GRP78的表达水平明显高于癌旁组织和正常组织(阳性率为73.5%)，且与性别、分化程度相关。其结果进一步提示GRP78是参与胃癌发生、发展的重要分子。为了进一步证实GRP78在促进胃癌细胞生长中的作用，本研究检测胃癌细胞SGC7901和过表达GRP78的SGC7901-H78细胞中，生长相关蛋白cyclin D1的表达变化情况。

Cyclin D1是细胞周期中短暂出现的基因表达产物，与特定的周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)结合构成复合体，可在G1/S 交界处将信号转导途径与细胞周期调控联系起来，而后降解[12]。研究发现，多种肿瘤发生时，cyclin D1蛋白过表达，G1期缩短，对生长因子的依赖性减少。由此，cyclin D1被认为是促进肿瘤生长和转移的重要分子[13-14]。在乳腺癌裸鼠移植瘤模型中，敲除cyclin D1b可抑制移植瘤的生长，下调cyclin D1b可促进阿霉素所致的细胞死亡[15]。本研究发现，在SGC7901-H78细胞中，随着GRP78表达的上调，cyclin D1蛋白表达增加，进一步证实GRP78是促进胃癌细胞生长的重要分子。而GRP78影响cyclin D1蛋白表达，调控胃癌细胞生长的机制有待进一步研究。

综上所述， GRP78在人体胃癌组织中高表达，且与性别、分化程度相关。检测胃癌细胞SGC7901和SGC7901-H78(过表达GRP78)中生长相关蛋白cyclin D1的表达发现，随着GRP78表达的上调，cyclin D1蛋白表达增加。

[参 考 文 献]

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