三种方法在检测泌尿生殖道淋病奈瑟菌感染中的比较研究

郑文振+蒲荣+向华国

作者简介：郑文振，男，主治医师，医学硕士，主要从事皮肤性病的临床及实验研究。Email:zwz247@163.com.

郑文振1，蒲荣1，向华国2

(1.广东省东莞市寮步医院，东莞 523400；2.广东省深圳市福永人民医院，深圳 518103)

【摘要】目的比较反向线点杂交技术（RLB）、实时荧光PCR(FQPCR)及培养法在检测泌尿生殖道淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae,NG）感染中的应用情况。

方法同时采集158例患者2份泌尿生殖道标本，提取其中1份标本NGDNA，PCR扩增NG 16S rRNA基因，然后与固定在尼龙膜上的特异性寡核苷核探针反向线点杂交；同时运用FQPCR检测NG的感染情况；另1份标本及时进行NG巧克力培养。

结果PCR扩增NG 16S rRNA基因的片段长度为412bp，具有较好的特异性，RLB检测158例标本中NG阳性为45例，阳性率为28.48%；FQPCR检测NG阳性为50例，阳性率为31.65%，二者比较差异无统计学意义（P＞005）；而培养法检测NG阳性为25例，阳性率为15.82%，明显低于RLB和FQPCR（P＜001）。

结论 与培养法相比，RLB与FQPCR在检测NG方面具有简便、快速且敏感性高等优点，且二者无明显差别。

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【关键词】淋病奈瑟氏菌；聚合酶链反应；核酸杂交；寡核苷核探针

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中图分类号：R691.3文献标识码：A文章编号：10031383(2014)03031004

DOI:10.3969/j.issn.10031383.2014.03.021

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Comparative study of three methods for detecting Neisseria gonorrhoeae infection in urogenital tract

ZHENG Wenzhen1,PU Rong1,XIANG Huaguo2

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(1.Liaobu Hospital of Dongguan,Dongguan 523400;2.Fuyong People's Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518103,Guangdong,China）

【Abstract】ObjectiveTo compare the application of reverse line blot hybridization assay (RLB),realtime fluorescent PCR(FQPCR) and cultivation methods in detecting Neisseria gonorrhoeae(NG) infection in urogenital tract.

MethodsTwo urogenital specimens of 158 patients were collected at the same time, from which NGDNA and PCR amplification NG 16s rRNA genes of one of the specimens were extracted to hybridize with the reverse line blot of specific oligonucleotide probe fixed on nylon membrane.FQPCR was used to detect NG infection at the same time.NG chocolate culture was performed in the other specimen.

Results Fragment length of PCR amplification NG 16S rRNA gene was 412bp with good specificity.RLB detection showed that 45 out of 158 cases had positive NG.The positive rate was 28.48%.Under the detection of FQPCR,NG of 50 cases were positive with a positive rate of 31.65%. There was no significant difference between two methods(P＞0.05).However,chocolate culture detection showed that 25 cases got positive NG with a positive rate of 15.82%,significantly lower than those of RLB and FQPCR (P＜0.01).

ConclusionCompared with chocolate culture,the RLB and FQPCR are simple,rapid and highly sensitive and there isno significant difference between the two methods.

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【Key words】Neisseria gonorrhoeae;polymerase chain reaction;nucleic acid hybridization;oligonucleotide probe

淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae,NG）感染泌尿生殖道引起的淋病是一种常见的性传播疾病(STI)，每年全世界大约有几百万人感染［1］。NG感染引起的淋病如其他STI一样，可合并感染，一种病原体感染可以成为另一种病原体感染的危险因素，因此尽早发现和及时治疗就显得尤为重要［2］。传统的检测方法革兰氏染色涂片法检测G-阴性双球菌其阳性率低，如采用培养法耗时长且受标本取材及送检条件的影响，阳性率较低。所以选择更加特异、敏感的检测方法检测NG具有十分重要的意义。近年来核酸扩增技术（NAATs）在NG感染检测方面发挥了重要作用，特别是PCR及其衍生技术，本文以NG16S rRNA基因作为靶基因设计PCR引物和探针，建立PCR结合反向线点杂交技术检测NG，并与实时荧光PCR和培养法检测结果进行比较。

1材料与方法

1.1 标本来源

收集2013年3月1日至2014年2月10日前来东莞市寮步医院皮肤性病科就诊患者的泌尿生殖道标本；每人同时收集2份标本，1份用于反向线点杂交技术（RLB）及实时荧光PCR(FQPCR)检测，另1份用于培养。158例患者中男性105例，其中尿液标本11例，尿道分泌物标本94例；女性53例，其中尿液标本5例，阴道分泌物标本48例。标准菌株如淋病奈瑟菌（WHO A1, A2, A3）、沙眼衣原体（ATCC VR902B）、解脲脲原体（ATCC 29342）及人型支原体（PG 21）为本院保藏菌株，脑膜炎奈瑟菌为本院临床分离株。

1.2主要试剂与仪器

HotStar Taq酶由QIAGEN公司生产，Biobyne C尼龙膜由Pall公司生产，链亲和素过氧化物酶接合物由Roch公司生产。TM淋球菌平板培养基为浙江威昱生物科技有限公司生产。ABI Steponeplus PCR扩增仪产自美国应用生物系统公司，Shellab杂交箱由Eppendorf公司生产。淋球菌核酸实时荧光PCR检测试剂由上海申友生物技术有限责任公司生产。VITEK2全自动微生物鉴定仪由法国梅里埃生物公司生产。

1.3PCRRLB检测NG的反应体系

PCR各组分含量为50 mol/L引物各0.25 μl，5 U/L HotStar Taq 酶0.2 μl，10×buffer 2.5 μl，4×10 mmol/L dNTP 0.25 μl，25 mol/L MgCl2 3 μl，模板5 μl，补水至25 μl。循环参数为95℃ 15 min后，95℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。反义引物SR60 5端用生物素标记，检测探针SR83的5端用氨基标记（见表1）。标记BiodyneC尼龙膜用0.5 μmol/L NaHCO3(pH8.4)稀释SR83探针浓度为0.625 μmol/L，具体方法参见文献［3，4］。

表1PCRRLB检测淋病奈瑟氏菌的引物和探针序列

项目解链温度(℃)b 靶基因Genbank序列号序列

Primer

SR6060.516S rRNAX07714536 TATTACCGCGGCTGCTG 520

〗

SR6860.916S rRNAX07714125 ATCGGAACGTACCGGGTAG 143

Probe

SR8360.316S rRNAX07714460 GTTGCCAATATCGGCG 475

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1.4RLB检测NG

参考文献［5］，加170 μl 2×SSPE/0.1%SDS溶液入1.5 ml EP反应管中，取5 μl PCR产物与其混匀后100℃煮10 min，然后置于冰中迅速冷却。将已与探针结合的尼龙膜用60℃ 2×SSPE/0.1%SDS液漂洗5 min，将膜置于Miniblotter反应板上，在反应板的槽中分别加入150 μl 2×SSPE/0.1%SDS和PCR扩增产物混合液。60℃杂交1 h，将膜置于60℃ 2×SSPE/0.5%SDS溶液中洗2次，每次10 min。然后加入2×SSPE/0.5%SDS和1/5000链亲和素过氧化物酶接合物混合液，42℃孵育1 h，再用42℃ 2×SSPE/05%SDS液洗膜2次，每次10 min。最后在室温下用2×SSPE液洗膜2次，每次5 min，加ECL覆盖于膜上，1 min后将膜显影5 min。

1.5特异性检测

用PCRRLB检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、解脲脲原体、人型支原体及脑膜炎奈瑟菌。

1.6实时荧光PCR检测NG

采用核酸扩增技术结合荧光标记探针杂交方法对NG的DNA进行定性检测。PCR扩增的总反应体系为25 μl，DNA模板为4 μl。循环参数：94℃预变性3 min；94℃ 7 s，60℃ 50 s（采集荧光），共40个循环，CT<38判为阳性。

1.7NG的培养及鉴定

及时保温送检泌尿生殖道标本，接种于已预温的TM平板上，置5%～10%CO2培养箱内，36.5℃培养24～36 h，观察菌落形态，挑取可疑菌落利用梅里埃VITEK2全自动微生物鉴定仪进行鉴定。

1.8统计学方法

利用SPSS 10.0软件进行统计分析，计数资料组间比较采用χ2检验，P＜005为差异有统计学意义。

2结果

2.1PCRRLB检测NG的特异性

16S rRNA PCR引物分别扩增沙眼衣原体、解脲脲原体、人型支原体结果均为阴性；可扩增淋病奈瑟菌412bp片段（图1），且只与相应的特异性探针杂交。16S rRNA PCR引物可以扩增脑膜炎奈瑟菌，但不与NG探针杂交。

图116S rRNA PCR引物各病原体凝胶电泳图谱

1：DNA标准参照物；2：沙眼衣原体；3：解脲脲原体；4：人型支原体；5：脑膜炎奈瑟菌； 6：淋病奈瑟菌（WHO A1）；7：淋病奈瑟菌（WHO A2）；8：淋病奈瑟菌（WHO A3）

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2.2三种方法在检测临床标本中的比较

158例患者中，经PCRRLB检测NG为阳性45例，阳性率为28.48%； FQPCR检测NG为阳性50例，阳性率为31.65%；二者比较无统计学意义（P＞0.05）；而培养法检测NG阳性为25例，阳性率为15.82%，明显低于RLB和FQPCR（P＜001）。见表1。

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表1三种方法在检测临床标本NG感染中的比较(n=158)

标本类型RLB阳性阴性

阳性阴性

培养法阳性阴性

尿液412511214

尿道分泌物346037571975

阴道分泌物741840444

合计45▲11350▲10825133

注：与培养法比较，▲P＜001。

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3讨论

从图1可以看出选用NG编码大亚基核糖体的16S rRNA基因作为检测靶基因，其引物不仅能扩增淋病奈瑟氏菌，还能扩增脑膜炎奈瑟氏菌，但不能扩增其他非奈瑟氏菌属病原体，如沙眼衣原体、解脲脲原体、人型支原体等泌尿生殖道病原体，说明引物具有属的特异性而不具有种的特异性。RLB检测时NG的特异性检测探针只与NG杂交，不与脑膜炎奈瑟氏菌杂交，避免了假阳性的发生。选择不同的基因位点作为检测NG的靶基因其检测结果不尽一致，考虑假阳性的同时也要考虑假阴性的发生，少部分菌株出现质粒缺失也会出现假阴性。结合多种方法对NG进行检测可以有效避免上述问题的发生。RLB技术是近年来在RDB的基础上发展起来的以尼龙膜为载体的低密度膜芯片技术［6］，结合力强，韧性强，能重复使用。需要用生物素标记反义引物的5端，化学发光检测能有效放大检测信号，敏感度高。与同位素标记探针结合放射性自显影技术相比，该技术无放射性污染。



从表1可以看出FQPCR检测NG的阳性率为31.65%，略高于RLB的阳性率（28.48%），二者比较差异无统计学意义。可能的主要原因是二者选取的检测靶基因不同，另外就是FQPCR是通过仪器自动实时探测荧光信号，敏感度高于化学发光胶片显影。FQPCR是目前应用得比较普遍的检测NG的分子生物学方法，市场上品牌众多，选用的检测靶基因不尽相同，应用于临床之前也应对其进行验证，包括与其他检测原理不同的方法进行比较。培养法检测NG的阳性率为15.82%，明显低于RLB和FQPCR，相比于PCR及其衍生技术培养法检测NG活菌，该菌抵抗力低，对标本的要求较高，要求保温、及时送检和接种，特别是冬天，最好是取材后马上接种，否则阳性率较低，但就目前而言，培养法仍是检测NG的金标准，缺点是耗时长，一般需要3天，阳性率较低。



不同研究人群包括不同症状、不同性别、不同受教育程度、不同类型标本NG的检出情况都会有所区别，一般情况下男性阳性率要高于女性［7，8］。本研究对三种不同方法检测NG进行了比较，着重对RLB检测NG进行了评价，其检测结果与FQPCR无明显差异。RLB和FQPCR的敏感性都明显高于培养法，可以有效防止漏检，这三种方法在一定条件下可以互相补充。

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参考文献

［1］ 向华国，熊礼宽，涂植光.淋病奈瑟菌感染的实验诊断进展［J］.重庆医学，2006，35(21):19951997.

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［2］ Tabrizi SN,Chen S,Tapsall J,et al.Epidemiology of sexually transmitted infections,HIV,and related highrisk behaviors among female sex workers in Guangxi autonomous region,China［J］. Japanese journal of infectious diseases,2012,65(1):7578.

［3］ 熊礼宽，罗进贤，杨应周，等．结核分枝杆菌DNA指纹技术研究及其应用［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2003，23(12):989994.

［4］ 向华国，熊礼宽，刘小立，等．膜芯片技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和3种支原体的方法学研究［J］. 中华微生物学和免疫学杂志，2007，27(8):758761.

［5］ Zwart G,van Hannea EJ,Kamstvan AM,et al.Rapid screening for freshwater bacterial groups by using reverse line blot hybridization［J］.Appl Environ Microbiol,2003,69(10):58755883.

［6］ Xiang HG,Xiong LK,Liu XL,et al.Rapid simultaneous detection and identification of six species Candida using polymerase chain reaction and reverse line hybridization assay［J］. Journal of Microbiological Methods,2007，69(2):282287.

［7］ 徐新蓉，马萍， 龚国富，等.不同症状淋球菌感染患者实验室检测方法选择与比较［J］. 国际检验医学杂志，2012，33(21):26372638.

［8］ 莫俊銮，张丽君，杨慧，等.1010例性病门诊患者泌尿生殖道病原体感染分析［J］. 中国艾滋病性病，2012，18 (12):871873.

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(收稿日期：2014-02-28修回日期：2014-06-10)

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(编辑：潘明志)

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不同研究人群包括不同症状、不同性别、不同受教育程度、不同类型标本NG的检出情况都会有所区别，一般情况下男性阳性率要高于女性［7，8］。本研究对三种不同方法检测NG进行了比较，着重对RLB检测NG进行了评价，其检测结果与FQPCR无明显差异。RLB和FQPCR的敏感性都明显高于培养法，可以有效防止漏检，这三种方法在一定条件下可以互相补充。

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［4］ 向华国，熊礼宽，刘小立，等．膜芯片技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和3种支原体的方法学研究［J］. 中华微生物学和免疫学杂志，2007，27(8):758761.

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［6］ Xiang HG,Xiong LK,Liu XL,et al.Rapid simultaneous detection and identification of six species Candida using polymerase chain reaction and reverse line hybridization assay［J］. Journal of Microbiological Methods,2007，69(2):282287.

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(收稿日期：2014-02-28修回日期：2014-06-10)

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(编辑：潘明志)

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不同研究人群包括不同症状、不同性别、不同受教育程度、不同类型标本NG的检出情况都会有所区别，一般情况下男性阳性率要高于女性［7，8］。本研究对三种不同方法检测NG进行了比较，着重对RLB检测NG进行了评价，其检测结果与FQPCR无明显差异。RLB和FQPCR的敏感性都明显高于培养法，可以有效防止漏检，这三种方法在一定条件下可以互相补充。

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［5］ Zwart G,van Hannea EJ,Kamstvan AM,et al.Rapid screening for freshwater bacterial groups by using reverse line blot hybridization［J］.Appl Environ Microbiol,2003,69(10):58755883.

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［7］ 徐新蓉，马萍， 龚国富，等.不同症状淋球菌感染患者实验室检测方法选择与比较［J］. 国际检验医学杂志，2012，33(21):26372638.

［8］ 莫俊銮，张丽君，杨慧，等.1010例性病门诊患者泌尿生殖道病原体感染分析［J］. 中国艾滋病性病，2012，18 (12):871873.

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(收稿日期：2014-02-28修回日期：2014-06-10)

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(编辑：潘明志)

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