姜黄素纳米粒（NanoCurcTM）联合索拉非尼对肝细胞癌（HCC）的协同抑制作用

胡 博 孙 超 孙 鼎 孙云帆 徐 泱

（复旦大学附属中山医院肝癌研究所 上海 200032）

姜黄素纳米粒（NanoCurcTM）联合索拉非尼对肝细胞癌（HCC）的协同抑制作用

胡 博 孙 超 孙 鼎 孙云帆 徐 泱△

（复旦大学附属中山医院肝癌研究所 上海 200032）

目的探讨姜黄素纳米粒（NanoCurcTM，NC）单药或联合索拉非尼对人肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的作用。方法采用体外细胞增殖检测试剂盒（CCK-8）、体外划痕试验和Transwell侵袭试验法检测NC和/或索拉非尼对肝癌细胞株MHCCLM3增殖、迁移、侵袭能力的影响；应用流式细胞术分析其对细胞凋亡的作用。建立裸鼠MHCCLM3原位移植模型并观察NC和/或索拉非尼对肿瘤大小和肺转移率的影响。应用RTPCR、ELISA、Western blot法检测基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）mRNA或相应蛋白表达变化；并测定ERK1/2的磷酸化变化。结果NC与索拉非尼联合应用可显著抑制HCC体外增殖和侵袭能力（P＜0.01），抑制体内肿瘤生长和肺转移（P＜0.01）。单独应用NC和索拉非尼时肺转移率分别为50.0%和66.7%，两者联合用药时则显著降低至16.7%。两药联合应用可协同抑制ERK磷酸化，从而下调MMP-9的表达。结论NC联合索拉非尼可通过协同诱导细胞凋亡、抑制MMP-9的表达而抑制肝癌生长和转移。

肝细胞癌（HCC）； 姜黄素纳米粒（NC）； 索拉非尼； 基质金属蛋白酶-9（MMP-9）

姜黄素是提取自姜科姜黄属植物姜黄根茎的一种酚化合物，具有抗炎、抗风湿和治疗肝、胆疾病等作用[1]。然而，姜黄素亲水性及亲脂性差，生物利用率低，极大限制了其临床应用[2]。相关研究证明姜黄素纳米粒（NanoCurcTM，NC）可显著提高姜黄素溶解度和生物利用率，减少用药剂量，并抑制肝肿瘤生长[3-4]。索拉非尼被美国FDA批准用于治疗不能手术切除和远处转移肝癌的靶向药物，但其价格昂贵、不良反应大，并且仍有约50%的晚期肝癌对其不敏感[5]。通过与其他药物联合应用，可降低索拉非尼的剂量，减少不良反应，增强药物疗效。而NC与索拉非尼联用尚未见报道。本研究旨在观察NC单药或联合索拉非尼对人肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的抗肿瘤作用，并探讨其作用机制。

材料和方法

药物姜黄素纳米粒（NanoCurcTM）由美国霍普金斯大学提供。索拉非尼购自德国拜耳公司，溶解于100%DMSO保存，体外实验中DMSO终浓度小于0.1%。

细胞培养肝癌细胞株MHCCLM3由复旦大学肝癌研究所建立，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基（美国Gibco公司），在37℃、5%CO2的细胞培养箱中常规培养。

细胞增殖实验将消化好的细胞按照3 000/孔接种于96孔板，培养过夜。待细胞贴壁后加药处理。分别予不同浓度NC（10、20、40、60、80μmol/L）作用于肝癌MHCCLM3细胞。培养不同时间后（24，48，72 h）每孔加入CCK8（杭州碧云天公司），孵育2 h。570 nm酶标仪（Model 680，美国Bio-Rad公司）测吸光度（D）值。分对照（DMSO）组、NC（40μmol/L）组、索拉非尼（10μmol/L）组及NC（40μmol/L）+索拉非尼组（10μmol/L），加药后培养48 h，按照上述方法检测。实验重复3次。

细胞凋亡实验按照试剂盒说明书操作，将MHCCLM3细胞以2×105/孔接种于6孔板中培养过夜，按上述方法分4组。经48 h处理后胰酶消化收集细胞，经400×g离心5 min并用Annexin-VFITC/PI试剂盒（美国BD公司）染色。避光孵育15 min，流式细胞术检测。实验重复3次。

细胞划痕实验细胞以1×105/孔接种于6孔板，常规培养；待细胞80%～90%融合时，弃去培养基，PBS漂洗1次，用灭菌的1μL Tip头在皿底划一直线，PBS漂洗2次。按上述分组方法处理细胞，并分别在0、24、48 h于倒置显微镜下拍摄。

细胞侵袭实验MHCCLM3细胞用Matrigel（美国BD公司）按1∶7稀释后，取75μL包被Transwell上室，置于37℃ 下4 h。细胞用胰酶消化、400×g离心5 min，加DMEM培养基制成含2×104个单细胞悬液500μL，加入Transwell上室中，并按上述分组方法加入存物。下室中加入含10%血清培养液。放入37℃培养箱常规培养24 h后固定，Giemsa染色，于倒置显微镜下随机选取3个视野计数染色细胞。实验重复3次。侵袭率（%）=用药孔穿膜细胞数/对照孔穿膜细胞数×100%。

人肝癌裸鼠原位模型及分组采用人肝癌细胞株MHCCLM3建立裸鼠原位肝癌模型[6]，将小鼠（上海斯莱克公司）随机分为NC组（NC每日1.56 g/kg）、索拉非尼组（索拉非尼每日30 mg/kg）、联合用药组（每日NC 1.56 g/kg+索拉非尼30 mg/kg）和对照组（PBS），每组6只。裸鼠于肿瘤接种后第7天开始用药，治疗持续4周。于种植后第5周末处死，切除肝脏肿瘤及肺脏，以10%甲醛固定。（1）计算肿瘤体积，V=AB2/2（A、B分别为肿瘤的最大和最小直径）。（2）连续切取30张肺组织切片做组织学检查，显微镜下观察，计算肺转移灶数目及肺转移率。

实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）细胞或组织抽提总RNA，按逆转录以及扩增试剂盒（日本Takara公司）说明书要求进行反应。MMP-9上 游 引 物：5＇-GCCAACTACGACACCGACGAC-3＇；下 游 引 物：5＇-TTGGCCTTGGAAGATGAATGGA-3＇。GAPDH 上游引物：5＇-GGCATCCTGGGCTACACTGA-3＇；下 游 引 物：5＇-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3＇。引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。ΔCt=目的基因ct值-GAPDH Ct值，ΔΔCt=用药组ΔCt的均数-对照组ΔCt的均数。实验重复3次。

酶联免疫吸附法（ELISA）1×105/孔细胞接种于6孔板上，常规培养，待细胞80%～90%融合时，按照上述分组处理。48 h后收集上清液，采用ELISA试剂盒（美国Invitrogen公司）检测MMP-9蛋白含量，实验步骤按照说明书进行。实验重复3次。

蛋白质印迹法（Western hlot）采用考马斯亮蓝法（Bradford法）检测标本组织抽提液中总蛋白的浓度，操作步骤参照说明书。NF-κB（p65）（#3034），p44/42 MAPK （Erk1/2）（#9102），TIMP1（D10E6）Rabbit mAb（#8946）购自美国CST公司；Anti-ERK1/ERK2抗体（#ab17942），MMP-9（#AB911）购自美国Abcam公司；Actin抗体（H-196）（#sc-7210），兔IgG-HRP（#sc-2749），鼠IgG-HRP（#sc-2748）购自美国Santa Cruz公司；RapidStepTMECL Reagent Millipore试剂（#345818）购自德国Millipore公司。

统计分析应用SPSS 19.0软件统计数据，计量资料用±s表示。组间比较用ANOVA方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

NC单药或联合索拉非尼对MHCCLM3细胞增殖能力的影响MHCCLM3细胞与NC有着剂量-时间依赖的关系，细胞存活率会随着剂量的增加及作用时间的延长而明显降低。作用24、48、72 h后NC的IC50值分别是40、35、33μmol/L （图1A）。联合用药组细胞存活率最低，但与NC（P=0.910）或索拉非尼（P=0.415）单药组相比，差异无统计学意义（图1B）。

图1 NC单药或联合索拉非尼抑制MHCCLM3细胞增殖能力和侵袭能力（×200）Fig 1 NC alone and in comhination with sorafenih inhihited MHCCLM3 cell proliferation and invasion（×200）A and B：Viability of MHCCLM3；C and D：MHCCLM3 transwell figure and data.（1）vs.Control，P＜0.01；（2）vs.NC，P＜0.05；（3）vs.So，P＜0.05.

NC单药或联合索拉非尼对MHCCLM3细胞迁移和侵袭能力的影响体外划痕实验结果显示，与对照组相比，用药组均使细胞迁移能力明显减弱。当联合用药时，细胞迁移能力弱于单药组。Transwell实验结果显示，与对照组相比，NC单独应用对侵袭有明显的抑制作用（P＜0.01），与索拉非尼单药相似（P＜0.01）；但联合用药组对细胞侵袭抑制作用强于单用NC或索拉非尼组（P＜0.05，图1C、D）。

NC单药或联合索拉非尼对MHCCLM3细胞凋亡的影响流式细胞术检测凋亡的结果见图2A。3个用药组与对照组相比，细胞凋亡率均显著升高（P＜0.01）。对照组的 MHCCLM3细胞凋亡率为9.36%±0.12%，NC单药组为17.40%±0.18%，索拉非尼单药组为15.39%±0.14%，两药联合组为22.85%±0.25%。联合组与NC单药组或索拉非尼单药组相比，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示两药联合应用具有明显的协同作用（图2B）。

图2 NC单药或联合索拉非尼诱导MHCCLM3细胞凋亡Fig 2 NC alone and in comhination with sorafenih induced MHCCLM3 cell apoptosisA：Flow cytometry of MHCCLM3；B：Apoptosis results of MHCCLM3.（1）vs.Control，P＜0.01；（2）vs.NC，P＜0.01；（3）vs.So，P＜0.01.

NC单药或联合索拉非尼对裸鼠肿瘤的抑制作用NC组肿瘤大小为（0.75±0.14）cm3（P＜0.05），索拉非尼组为（0.50±0.11）cm3（P＜0.01），联合组为（0.45±0.09）cm3（P＜0.01），均显著低于对照组（1.26±0.13）cm3（图3）；NC或索拉非尼单药组肺转移率分别为50.0%和66.7%，对肿瘤肺转移抑制作用差异无统计学意义（P=0.182，P=0.455）。联合用药在未明显增加药物不良反应的基础上，肺转移率为16.7%，对肺转移具有显著的抑制作用（P=0.015，表1）。

图3 NC单药或联合索拉非尼抑制体内肿瘤生长及肺转移率Fig 3 NC alone and in comhination with sorafenih inhihited tumor volume and incidence of lung metastasisvs.Control，（1）P＜0.05，（2）P＜0.01；（3）vs.NC，P＜0.05.

表1 裸鼠肝癌原位移植模型结果Tah 1 Summary of orthotopic xenograft liver tumor moddel in nude mice

NC单药或联合索拉非尼对肝细胞癌MMP-9和p-ERK表达的影响ELISA和Western blot结果显示，在肝癌细胞及小鼠肝癌组织中，MMP-9和p-ERK在对照组中的表达量最高，其在NC单药和索拉非尼单药组的表达水平较对照组明显下调，联合用药组的表达量最低；而MMP-9抑制剂TIMP-1的表达则正好相反，在对照组中的表达量最低，在两药联合组中表达量最高（图4B、D、E）。各组ERK未见明显变化。在m RNA水平，实验结果与上述结果一致，在用药组与对照组及联合用药组与单药组间，MMP-9 mRNA表达水平差异均具有统计学意义（P＜0.01，图4A）；然而，在体内试验中，联合用药组与单药组差异无统计学意义（图4C）。

图4 NC单药或联合索拉非尼抑制MMP-9和p-ERK在体内、外的表达Fig 4 NC alone and in comhination with sorafenih decreased MMP-9 and p-ERK expressionin vitroandin vivoA：MMP-9 mRNA of MHCCLM3in vitro；B：MMP-9 ELISA resultsin vitro；C：MMP-9 mRNA in liver tumor model；D：MMP-9 ELISA results in tumor model；E：Western blot resultsin vitroandin vivo.A：（1）vs.Control，（2）vs.NC，（3）vs.So，P＜0.05；B and D：（1）vs.Control，P＜0.05，（2）vs.Control，P＜0.01，（3）vs.NC+So，P＜0.01，（4）vs.NC，P＜0.05；C：（1）vs.Control，P＜0.05.

讨 论

近几年，肿瘤治疗虽然取得长足进步，诸如手术、介入及肝移植等方法的采用，但肝癌总体5年生存率仍仅为15%[7-8]。化学治疗因其自身优点受到越来越多的重视，因此对抗肿瘤效果好且不良反应小的药物的需求不断增加。目前，研究人员将注意力集中在天然药物上。天然产物已经成为抗癌药物的重要来源，约70%抗癌药物提取自天然产物[9]。

NC克服了姜黄素水溶性差的缺点，增强了其治疗效果，并可改善四氯化碳引起的肝损伤和肝硬化[10]。本研究结果显示，小剂量NC能够显著抑制MHCCLM3细胞的增殖、迁移和侵袭能力。这一结果与高剂量姜黄素对肝癌细胞HEP3B，SK-Hep-1和SNU449抑制能力相似[11]。此外，有研究发现，姜黄素与阿霉素联合应用可产生协同抗肿瘤作用，我们推测NC可与其他经典肝癌治疗药物联合应用。因此，本研究选择索拉非尼与NC联合应用。结果显示，相比单药，NC与索拉非尼联合应用能更好地抑制MHCCLM3细胞的体外侵袭能力。在裸鼠原位肝癌模型中，我们发现联合用药可协同抑制肿瘤生长。由于肝癌肺转移占肝外转移的50%以上，我们重点检测联合用药对肝癌肺转移的作用[12-13]。结果显示，肺转移率显著降至16.7%。

为探讨两种药物协同抗肝细胞癌的作用机制，本研究采用流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示NC和索拉非尼联合使用时，细胞凋亡比单独使用NC或索拉非尼时更显著。肿瘤细胞分泌的MMP-9是最为主要的基质金属蛋白酶，可降解细胞外基质成分，促进肿瘤的转移[14-15]。体内、体外试验结果表明，联合用药可通过下调ERK1/2磷酸化水平，下调MMP-9表达，最终达到协同增强抗肿瘤效果的作用。此外，联合用药克服了单一药物治疗疗效不足的缺点。近期，Liang等[16]报道EF24（与姜黄素分子结果类似）可逆转索拉非尼耐药。这一发现提示，NC与索拉非尼联合应用可有效治疗肝细胞癌，具有良好的临床应用前景。

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Synergistic antitumor effects of polymeric nanoparticle formulation of curcumin（NanoCurcTM）comhined with sorafenih in human hepatocellular carcinoma（HCC）

HU Bo，SUN Chao，SUN Ding，SUN Yun-fan，XU Yang△
（Liver Cancer Institute，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai200032，China）

hepatocellular carcinoma （HCC）； NanoCurcTM（NC）； sorafenib； matrix metalloproteinase-9（MMP-9）

R 735.7

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.02.001

2013-12-12；编辑：张秀峰）

国家科技重大专项（2013ZX10002011-004）；国家自然科学基金（81372317，81071661）；上海浦江人才计划（13PJD007）

△Corresponding author E-mail：drxuyang@gmail.com

【Ahstract】 OhJectiveTo investigate the effect of polymeric nanoparticle formulation of curcumin（NanoCurcTM，NC）alone and in combination with sorafenib usingin vitroandin vivomodels of human hepatocellular carcinoma（HCC）.MethodsThe activity of NCalone and in combination with sorafenib on HCC cell lines（MHCCLM3）was determined by CCK8，wound-healing and modified Boyden chamber assays.Apoptosis of cells was detected by flow cytometry.Primary HCC tumor growth and metastasis were examinedin vivousing orthotopic HCC xenografts in nude mice.RT-PCR，Western blot and ELISA were used to determine the expressions of matrix metalloproteinase-9 （MMP-9），tissue inhibitor of metalloproteinase-1（TIMP-1），extracellular sinal-regulated kinase 1/2（ERK1/2）and phosphorylated ERK 1/2（p-ERK1/2）.ResultsNC combined with sorafenib significantly inhibited the proliferation and invasion of MHCCLM3 cellsin vitro（P＜0.01），also drastically suppressed primary tumor growth and lung metastasesin vivo（P＜0.01）.Lung metastatic rate was 50.0%and 66.7%when NC and sorafenib wasused alone separately，and descended to 16.7%when NC and sorafenib were combined.NC combined with sorafenib could synergistically down-regulate the expression of MMP-9 via inhibiting p-ERK1/2 expression.ConclusionsCombination of NC and sorafenib showed synergistic inhibition effects on tumor growth and metastases by inducing cell apoptosis and inhibiting the expression of MMP-9.

*This work was supported hy the National Key Sci-Tech ProJect（2013ZX10002011-004），National Natural Science Foundation of China（81372317 and 81071661），and PuJiang Scholars Fund of Shanghai（13PJD007）.