HPLC法测定藏药巴桑母酥油颗粒中没食子酸的含量

赖先荣 何新友

HPLC法测定藏药巴桑母酥油颗粒中没食子酸的含量

赖先荣 何新友

目的建立藏药巴桑母酥油颗粒中没食子酸的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定巴桑母酥油颗粒中没食子酸的含量，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱Welch Materials，流动相为乙腈—0.1%磷酸水溶液(3∶97)，流速为1.0 ml/min；柱温为30℃，检测波长为215 nm，外标一点法定量。结果没食子酸在0.2～1.6 μg范围内，与峰面积积分值线性关系良好(n=6)。该方法的平均回收率为98.34%，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为1.62%(n=9)。四批样品的含量分别是0.3224 mg/g、0.3354 mg/g、0.3288 mg/g、0.3269 mg/g。结论高效液相色谱法准确、简便、快速，适合于该制剂的质量控制。

藏药； 巴桑母酥油颗粒； 没食子酸； 高效液相色谱法； 含量测定

巴桑母酥油丸是藏医常用的滋补经验方，具有壮阳益肾，养心安神，强筋骨的功能，用于心悸失眠、脾胃不和、老年虚弱、经络不利、肢体僵直、肾虚、阳痿不举、虚损不足症，由诃子、毛诃子、余甘子、黄精、天冬、西藏棱子芹、蒺藜、喜马拉雅紫茉莉八种藏药及酥油、牛奶、白糖、炼蜜等藏医特色辅料制成，其质量标准项下仅有处方、制法、性状、检查、功能与主治、用法与用量、规格等质量控制项目[1]，缺乏含量测定项目。巴桑母酥油颗粒是其改变剂型品种，提高了成品对温度的耐候性，其处方剂量与原剂型巴桑母酥油丸一致。

巴桑母酥油颗粒处方中诃子、毛诃子、余甘子用量占总处方量的三分之一以上，其主要指标成分为没食子酸[2]。没食子酸具有较强的抗肿瘤和抗氧化等作用[3]，其含量测定方法主要采用高效液相色谱法[2]。本文采用高效液相色谱法，具有快速、灵敏、重现性好等特点，同时采用自动进样器可以减少人为因素影响，其重复性、精密度良好，测定结果可信。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-2010A HT高效液相色谱仪(四元泵、在线真空脱气机、自动进样器、智能化柱温箱、紫外检测器)；岛津LC Solution色谱工作站；BP211D电子天平(德国Sartorius公司)；Q-250型超声波清洗器(上海必能信仪器制造有限公司)；Lambda 35 UV/Vis Spectrometer(美国Perkin Elmer公司)。

1.2 试药

甲醇(分析纯，成都科龙化学试剂公司)、石油醚(60～90℃)(分析纯，成都科龙化学试剂公司)、乙腈(色谱纯，Fisher Scientific)、磷酸(85%，分析纯，成都科龙化学试剂公司)、水为去离子水，其它试剂均为分析纯。

没食子酸(含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供，批号：110831-200302)。

1.3 样品来源

巴桑母酥油颗粒(批号20110201、20110301、20110302、20110303，由成都中医药大学民族医药学院提供，规格为每袋装25 g)。

诃子、毛诃子、余甘子用量占总处方量的三分之一以上，其主要指标成分为没食子酸[2]。按巴桑母酥油颗粒的处方比例及制备工艺，制成缺诃子、毛诃子、余甘子的阴性样品制剂。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件

采用十八烷基硅烷键合硅胶柱Welch Materials(钻石)(4.6 mm×250 mm，5 μm，柱号Wel518425)。流动相为乙腈—0.1%磷酸水溶液(3∶97)；流速1.0 ml/min；柱温：30℃；检测波长215 nm。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品适量，置10 ml量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为没食子酸对照品溶液贮备液(2 mg/ml)。精密吸取上述没食子酸对照品贮备液2.5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为没食子酸对照品溶液(0.2 mg/ml)。

2.3 供试品溶液的制备

取装量差异项下的样品适量，研细，取10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入石油醚(60～90℃)100 ml，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)30分钟，放冷，滤过，弃去石油醚液，残渣水浴挥干溶剂，连同滤纸移入锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率33 kHz)1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 系统适用性

按2.1项色谱条件测定，对照品溶液与供试品溶液在相同的保留时间处有相同的色谱峰，供试品溶液有效峰与杂峰能很好分离，分离度大于1.5，拖尾因子不超过1.05，阴性对照液与对照品溶液及供试品溶液在相同的保留时间处无相应的色谱峰，见图1-4。

图1 没食子酸对照品紫外光谱扫描图

图2 没食子酸对照品HPLC色谱图

图3 巴桑母酥油颗粒HPLC色谱图

图4 巴桑母酥油颗粒阴性样品HPLC色谱图

2.5 线性关系考察

分别精密吸取上述对照品溶液1.0 μl、2.0 μl、4.0 μl、5.0 μl、6.0 μl、8.0 μl注入色谱仪，测定峰面积积分值，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品的量(μg)(X)为横坐标进行线性回归，得没食子酸回归方程Y= 7664116X(r=0.9999)。结果表明没食子酸对照品的量在0.2～1.6 μg在范围内的线性关系良好。

2.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液(0.2 mg/ml)5 μl，重复进样6次，测定峰面积积分值。结果表明相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为0.61%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

因没食子酸见光易发生变化，要求避光保存[3]，故考察对照品溶液、供试品溶液在阴暗处室温密闭放置的稳定性。

取对照品溶液(0.2 mg/ml)，置阴暗处室温密闭放置，在12小时内的不同时间间隔取出测定其峰面积积分值。结果RSD为0.98%(n=6)，表明在12小时内对照品溶液稳定性良好。

取供试品溶液(批号20110201)，置阴暗处室温密闭放置，在12小时内的不同时间间隔取出测定其峰面积积分值。结果RSD为1.10%(n=6)，表明在12小时内供试品溶液稳定性良好。

2.8 重复性试验

取本品(批号20110201)，按2.3项相同方法分别制备6份供试品溶液，测定没食子酸含量，结果平均含量为0.3224 mg/g，RSD为1.56%。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品(批号20110201)约5.0 g，各精密加入没食子酸(0.2 mg/ml)对照品溶液8.0 ml，挥干溶剂，按3.3项相同方法分别制备9份供试品溶液，测定没食子酸含量，计算回收率，平均回收率为98.34%，RSD为1.62%(n=9)。结果见表1。

表1 回收率试验结果(n=9)

2.10 阴性样品测定

取巴桑母酥油颗粒的阴性样品(不含诃子、毛诃子、余甘子)，按2.3项相同方法制备阴性样品供试品溶液，依法测定，在没食子酸对照品相应的位置上，未见到相应的色谱峰。结果表明：巴桑母酥油颗粒中其他药味及辅料不影响没食子酸的测定结果。

2.11 样品测定

取本品4批，按2.3项相同方法分别制备供试品溶液，测定没食子酸含量，含量分别是0.3224 mg/g、0.3354 mg/g、0.3288 mg/g、0.3269 mg/g(n=2)。

3 讨论

由于巴桑母酥油颗粒以酥油作为藏医特色辅料(约30%)，酥油熔点为34℃且降低色谱柱的理论塔板数，根据没食子酸极性较大的性质并参考文献[4-5]，首先采用石油醚对样品进行脱脂处理，再用70%甲醇超声提取，没食子酸出峰时间适宜、峰形对称性良好、加样回收率符合要求，结果达到很好的效果。

文献报道没食子酸的含量测定采用甲醇—磷酸溶液[6]和甲醇—十六烷基三甲基溴化胺-N,N二甲基甲酰胺—磷酸溶液[7]作为流动相，但实验中采用甲醇—磷酸溶液作为流动相时，理论塔板数偏低，没食子酸峰形差，且保留时间过长；而采用乙腈—磷酸溶液作为流动相时，理论塔板数达5000以上，没食子酸出峰时间适宜、峰形对称、尖锐，分离度较好。

没食子酸对照品甲醇溶液在200～500 nm波长范围内，测得其在215 nm、272 nm处均有吸收峰、在215 nm有最大吸收峰，比较相同色谱条件下样品于215 nm和272 nm波长下的色谱图：检测波长为215 nm的色谱图没食子酸峰可以与其它峰达到良好的基线分离，且重现性好，阴性无干扰，峰形良好；在272 nm的检测波长下，供试品溶液的没食子酸色谱峰分离度不能达到要求(色谱峰前沿有干扰小峰出现，说明有干扰物质在275 nm处吸收值较高、在215 nm处吸收值较低)，峰形较差，因此选择215 nm作为检测波长。

本试验建立的HPLC法测定巴桑母酥油颗粒中没食子酸的含量，色谱峰之间能有效分离，精密度、重复性及线性关系好，回收率数值符合规定，故认为该方法简便易行、稳定可靠，可提高巴桑母酥油颗粒的质量控制水平。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会，中华人民共和国卫生部药品标准(藏药第一册)[S].北京：中华人民共和国卫生部药典委员会，1995：297.

[2]郑海杰，耿志鹏，冯冠榕，等.高效液相色谱法测定藏药多血康中没食子酸的含量[J].中国科技论文在线，2009，2(11)：1163-1166.

[3]柯发敏，张开莲.没食子酸的研究进展[J].泸州医学院学报，2011，34(4)：440-442.

[4]孙文基，谢世昌.天然药物成分定量分析[M].北京：中国医药科技出版社，2002：175.

[5]刘东辉，古星妙，袁冬生，等. HPLC法测定宫炎平分散片中没食子酸的含量[J].中药新药与临床药理，2006，17(14)：277-279.

[6]刘舜慧，吴春敏.反相高效液相色谱法测定青果颗粒中没食子酸的含量[J].海峡药学，2008，20(1)：30-32.

[7]邓科君，张艺，王平，等.反相高效液相色谱法同时测定藏药广枣中没食子酸和原儿茶酸的含量[J].色谱，2006，24(6)：652-653.

(本文编辑：董历华)

ContentdeterminationofgallicacidinTibetanmedicineBasangmubuttergranulesbyHPLC

LAIXian-rong，HEXin-you.

EthnomedicineCollege，ChengduUniversityofTraditionalChinese.Medicine，Chengdu611137，China

LAIXian-rong，E-mail：laixianrong@163.net

ObjectiveTo establish a content determination method of gallic acid in Tibetan medicine Basangmu butter granules.MethodsThe content of gallic acid in Basangmu butter granules was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) , the chromatographic column was Welch Materials C18 , the mobile phase was acetonitrile and 0.1% phosphoric acid water solution at rate 3:97, the flow rate was set as 1.0 ml/min, column temperature was set as 30 ℃, detection wavelength was set as 215 nm, used external standard method.ResultsThe gallic acid concentration had a good linear relation with peak area integral quantity in the range of 0.2～1.6 μg (n=6), the average recovery rate was 98.34%, and relative standard deviation(RSD) was 1.62% (n=9). Four batches content were 0.3224 mg/g, 0.3354 mg/g, 0.3288 mg/g and 0.3269 mg/g respectively.ConclusionThe method had showed high accuracy, reliability and reproducibility, so it can be used in the quality control of the preparation.

Tibetan medicine； Basangmu butter granules； Gallic acid； High performance liquid chromatography； Content determination

四川省高校科研创新团队建设计划(11TD004)；成都中医药大学藏药学特色专业建设项目(2012-特色-5)；成都中医药大学藏药学专业综合改革项目(2012-专业-13)；西藏藏医学院藏药有限公司资助项目

611137 成都中医药大学民族医药学院

赖先荣(1971-)，本科，副研究员。研究方向：中药及民族药创新药物的研究与开发。E-mail:laixianrong@163.net

R29

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.02.008

2013-11-20)