高效液相色谱法测定精制银翘解毒片中连翘苷的含量

吴 娟

高效液相色谱法测定精制银翘解毒片中连翘苷的含量

吴 娟

目的 建立测定精制银翘解毒片中连翘苷含量的方法。方法 采用高效液相色谱法（HPLC）测定，使用C18柱（Diamonsil ODS，200.0 mm×4.6 mm，5 μm），柱温箱35 ℃，以乙腈-水（24:76）为流动相，检测波长230 nm；流速为1 ml/min。结果 采用HPLC测定连翘苷含量，连翘苷在0.0967～0.9670 μg范围具有良好的线性关系；连翘苷平均回收率为99.1%。结论 高效液相色谱法灵敏度高，重复性好，所建立的连翘苷含量测定方法能有效控制银翘解毒片的质量。

精制银翘解毒片；连翘苷；高效液相色谱法；含量测定

精制银翘解毒片收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第三册，由金银花、连翘、对乙酰氨基酚等组成，具有清热散风、解表退热功能，用于流行性感冒、发冷发热、四肢酸懒、头疼咳嗽、咽喉肿痛、温毒发斑、脸腮赤肿。原标准采用了紫外分光光度法只测定了对乙酰氨基酚的含量，鉴别也只有对乙酰氨基酚的薄层鉴别，对处方中其他中药无任何控制指标，而金银花的有效成分绿原酸在测定波长249 nm也有紫外吸收，必然影响对乙酰氨基酚含量测定的准确度[1-3]。通过测定不同厂家的制剂发现，个别厂家的精制银翘解毒片根本无法检测到连翘苷。通过高效液相色谱法（HPLC）测定精制银翘解毒片中的对乙酰氨基酚和绿原酸含量颇多，本文采用HPLC法测定精制银翘解毒片中的连翘苷含量可用于该制剂的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 实验材料 连翘苷对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号110821-200610）；精制银翘解毒片（太极集团四川绵阳制药有限公司，批准文号：国药准字Z51020282，批号：55120004）；缺连翘的阴性样品自制。

1.2 实验试剂 乙腈（色谱纯）；甲醇（分析纯）；乙醇（分析纯）；中性氧化铝。

1.3 实验仪器 Agilent Technologies 1260 高效液相色谱仪（Agilent Technologies 1260紫外检测器、四元泵、二极管阵列检测器1260Infinity、自动进样器）；Diamonsil C18柱（Diamonsil ODS，200.0 mm ×4.6 mm，5 μm）；AY120电子天平（SHIMADZH）；CH-250型超声清洗机（北京创新德超电子研究所）。

2 方法与结果

2.1 检测波长选择 参考《中华人民共和国药典》一部（2010年版），单味药连翘的有效成分连翘苷含量测定检测波长为277 nm[4-5]，测定连翘的指标性成分连翘苷的检测波长为230 nm，在试验过程中，连翘苷的检测波长在230 nm时吸收值较277 nm大且无干扰，所以在精制银翘解毒片中连翘苷含量测定选择检测波长为230 nm。

2.2 色谱条件 Diamonsil C18柱（Diamonsil ODS，200.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈:水（24:76）；检测波长230 nm；流速1.0 ml/min；柱温：35 ℃。

2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 ml甲醇，密塞，称定重量，超声处理10 min，放置室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液25 ml置蒸发皿中蒸至微干，加入0.5 g中性氧化铝拌匀，加在中性氧化铝柱（100～200目，1 g，内径1.0～1.5 cm）上，用70%乙醇80 ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣加50%甲醇适量使溶解，转移至10 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 对照品溶液的制备 精密称取连翘苷0.00967 g，置20 ml量瓶中，加甲醇溶液并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液，精密量取上述贮备液1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.5 系统适用性试验 分别取连翘苷对照品溶液、供试品溶液和缺连翘的阴性空白溶液注入液相色谱仪，记录色谱（图1～3），从图中可见，连翘苷在该条件下，保留时间为20.8 min，阴性空白色谱图在连翘苷位置处无干扰峰，连翘苷和其他相近的峰完全分离（分离度＞1.5），即本试验条件下连翘苷与其他组分分离完全，理论塔板数以连翘苷计算为3000。

图1 连翘苷对照品

图2 精制银翘解毒片样品

图3 精制银翘解毒片连翘空白样品

2.6 提取时间的确定 考察甲醇为溶剂，比较不同超声提取时间，结果提取10 min、20 min、30 min连翘苷含量无明显差异，故从工作效率考虑选取超声提取10 min（表1）。

表1 不同超声时间连翘苷的提取结果

2.7 线性关系考察 分别精密吸取连翘苷对照品溶液（0.04835 mg/ml）2 μl、5 μl、10 μl、15 μl、20 μl进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，连翘苷进样量（μg）为横坐标进行线性回归，得回归方程：y（连翘苷）=2073.3x+9.0691，R2=0.9999；连翘苷进样量在0.0967～0.9670 μg范围内与峰面积具有良好线性关系（图4）。

图4 连翘苷线性关系

2.8 精密度试验 精密吸取连翘苷对照溶液（0.04835 mg/ml）10 μl，分别进样5次，连翘苷峰面积相对标准偏差（RSD）为0.68%，结果表明精密度良好（表2）。

2.9 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样10 μl，连翘苷峰面积RSD为0.66%，说明溶液在24 h内测定稳定（表3）。

2.10 复性试验 取同一批次供试品6份（55120004），按2.3项下操作制得供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样分析并记录峰面积，结果表明本方法重复性良好，见表4。

表2 精密度试验(n=5)

表3 稳定性试验(n=6)

表4 稳定性试验(n=6)

2.11 回收率试验 取6份已知含量的同一批样品（55120004）各约1 g，精密称定，置50 ml容量瓶中，加入适量对照品溶液，按2.3项制备供试液，按2.2色谱条件进样，记录峰面积，计算回收率。结果平均回收率为99.1%，RSD为0.71%，见表5。

表5 加样回收试验结果(n=6)

2.12 样品含量测定 依法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，按上述方法测定，样品（55120004）含连翘苷为每片0.1565 mg，精制银翘解毒片平均片重为0.2680 g。

3 讨论

3.1 连翘主要含有连翘苷、连翘脂、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸等多种成分，参考有关资料，鉴别连翘多选择连翘苷作为本品含量测定的控制指标。测定连翘苷的含量，所采用的方法有紫外分光光度法、薄层扫描法等，但以上方法误差较大，而采用HPLC法测定连翘苷含量，色谱条件如上文所述，连翘苷与其他组分分离度好，重复性，精密度，回收率高。故选用HPLC测定连翘所含的有效成分连翘苷。

3.2 确定色谱条件时，用不同的色谱柱和不同品牌的高效液相色谱仪要达到良好的分离效果所使用的流动相比例不同，但比例波动不会很大。在实际工作中，参照药典进行检验时也可根据色谱图分离度的好坏对流动相比例进行调节。

3.3 有文献表明，用HPLC测定连翘中的连翘苷含量曾有不经过过氧化铝柱的过程，此法在进行药品检验过程中虽然简化了检测过程，节省了工作时间，但药品对色谱柱的损害较大，明显缩短了色谱柱的使用寿命。所以，此方法不可取。

3.4 在试验过程中，曾采用40、60、80 ml 70%乙醇洗脱，结果发现在氧化铝柱中，40 ml 70%的乙醇便可洗脱完毕，但在实际操作过程中，蒸发皿蒸至渐干后用氧化铝拌干过程中有大量的物质残留于蒸发皿内，需用洗脱液溶解过柱，按照少量多次的原则进行清洗，要保证洗脱完全，则洗脱液应控制在80 ml左右。

参与文献

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂(第三册)[M].北京: 中华人民共和国卫生部药典委员会,2001:198-198.

[2] 中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010:159-159.

[3] 俞崇灵.连翘抗菌成分的研究[J].药学学报,1960,8(6):241-244.

[4] 苏永林,陈卓,姚静.高效液相法测定桑菊感冒合剂中连翘苷的含量[J].河南中医,2012,32(7):920-921.

[5] 李会.勤清喉咽合剂中连翘苷的含量测定[J].当代医学,2011, 17(3):51-52.

Content determination of forsythin in JinzhiYinQiaojiedu tablets by HPLC

Wu Juan

Objective To establish a method for content determination of forsythin in Yinqiaojiedu tablets.Methods Using HPLC,usingC18column( Diamonsil ODS,200.0 mm×4.6 mm,5 μm),35 ℃ column temperature box,using acetonitrile and water(24:76) as mobile phase,the detection wavelength was 230nm;the flow rate was 1 ml/min.Results Using high performance liquid chromatographydetermination of phillyrin in Forsythia rule,has a good linear relationship in the range of 0.0967～0.9670 μg phillyrin;the average recovery rate was 99.1%.Conclusion The HPLC method has high sensitivity,good reproducibility,can be used for the quality control of Yinqiao Jiedu tabletmethod for determination of phillyrin the.

YinQiaojiedu tablets;Forsythin;HPLC;Content determination

R927.2

A

1673-5846(2014)08-0017-03

毕节市食品药品检验所，贵州毕节 551700