牡丹皮化学成分的HPLC-QTOFMS分析

赵文军，林 阳，李鹏飞，刘 洋(.沈阳军区联勤部药品仪器检验所，辽宁 沈阳 006；.第二军医大学药学院，上海 00433)

牡丹皮(Moutan cortex)为临床常用中药，系毛茛科芍药属植物牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr)的干燥根皮，在我国主产于安徽、山东、四川、陕西等地[1]。牡丹皮资源丰富，具有显著抗炎[2]、抗糖尿病[3]、保护缺血组织[4]、抗肿瘤[5]的等药理活性，因而具有良好的开发前景。

中外学者研究发现牡丹皮的主要化学成分为没食子酸、芍药苷衍生物、没食子酰糖苷等[6-8]。对牡丹皮中化学成分分析已有文献报道[9，10]，以采用传统的植物化学的方法进行分离提取居多。液相色谱与飞行时间质谱联用(HPLC-QTOFMS)对于中药复杂体系中化学成分分析和鉴定非常有效。其灵敏度高，可以在短时间获得化合物的准确分子质量，通过比对已建立的已知化学成分数据库，能对被测成分进行快速分析鉴别。因此，相比于传统的中药分析手段，在线联用技术具有显著的优越性[11]。本研究采用HPLC-QTOFMS技术对牡丹皮中多成分进行了鉴别，该法操作简便、快速、准确，对阐明牡丹皮药效的物质基础、质量控制、开发现代中药新药等具有重要意义。

1 仪器与试药

安捷伦-1200液相色谱系统，包括在线脱气机、二元泵、高性能自动进样器、柱温箱；安捷伦-6530高分辨四级杆-飞行时间质谱仪，配有标准电喷雾离子源(ESI)，Masshunter工作站和Analyst Qualitative Analysis质谱分析软件；KUDOS SK2200H型超声器(上海科导超声仪器公司)；METTLER AE240型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；DJ-04型药材粉碎机(上海淀久公司)，高速离心机(美国Abbort公司)。

HPLC级乙腈(德国Merck公司)；HPLC级甲酸(美国Tedia公司)；无水乙醇为分析纯(中国医药集团上海化学试剂公司)，水为娃哈哈纯净水。丹皮酚、芍药苷和没食子酸对照品(纯度﹥98%，中国药品生物制品检定所)。牡丹皮药材(上海德康大药房，产地安徽，批号：100622)。

2 方法

2.1色谱及质谱条件

2.1.1色谱条件色谱柱 SHISEIDO CAPCELL PAK C18(3.0×100 mm, 3 μm)；流动相：0.1 %甲酸水溶液(A相)-乙腈(B相)，梯度洗脱：0～3 min, 5% B; 3～15 min, 5%～20% B; 15～25 min, 20%～27% B; 25～34 min, 27%～46% B; 34～40 min, 46%～95% B；柱温：25℃；进样量：2 μl；流速：0.5 ml/min；进样前以流动相梯度初始条件平衡10 min。

2.1.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，分别在正、负离子模式下检测：采用三通分流阀，柱后分流比为1:1，使大约1/2体积的液相洗脱液进入质谱检测。具体参数如下：毛细管电压正离子模式4 000 V，负离子模式3 500 V，雾化气压力35 psi，干燥气流速10 L/min，干燥气温度350℃，碎片电压150 V；质量数扫描范围m/z100～1 200。每次测定样品之前，采用混标调谐液(turning mixture)校准质量轴，以保证质量精度误差﹤5 ppm。

2.2供试品溶液的制备 取牡丹皮药材适量，粉碎后过40目筛，称取牡丹皮药材0.5 g，置100 ml锥形瓶中，加80%乙醇50 ml，超声处理30 min(超声功率为400 W，频率60 kHz)，冷却后补足失重。取5 ml醇提液，10 800 r/min离心5 min，取上清，再用微孔滤膜过滤(0.45 μm)过滤，作为供试品溶液。在“2.1.1”项下色谱条件下进样分析。

2.3对照品溶液的制备 精密称取没食子酸、芍药苷、丹皮酚对照品加甲醇溶解于适当量瓶中，配成浓度分别为36.01、42.23、43.12 μg/ml的混合对照品溶液，作为对照品储备液，分别取各对照品混合液稀释混合后，进样分析。

2.4牡丹皮化学成分数据库的建立 检索美国国立生物技术信息中心(NCBI)的PubMed数据库、美国化学学会SciFinder数据库和清华大学的CNKI数据库，将文献中有关牡丹皮的化合物数据进行全面收集整理，利用安捷伦“formula_database_generator”软件建立了75个牡丹皮化学成分的数据库，包括没食子酸、芍药苷衍生物、没食子酰糖苷类等化学成分，并对其化合物名称、结构、化学式、精确分子量信息进行系统整理。

3 结果与讨论

3.1色谱和质谱条件优化 实验初始笔者分别考察了不同品牌、规格的色谱柱，结果发现CAPCELL PAK C18柱(3.0 mm×100 mm, 3 μm)分析时间更短并且峰形更好，适合牡丹皮不同化学成分的分离。乙腈-水体系的分离时间较甲醇-水短，可以提高分离效率，而乙腈-0.1%甲酸水的体系能使化合物得到更好的分离效果。

实验中分别采用了正、负离子模式进行全扫描检测。在负离子模式下，基质干扰较少，且牡丹皮成分响应很高。而在正离子模式下，少部分成分响应较差，但能得到牡丹皮主要成分的碎片离子以有助于成分的鉴别。因此，最终采用以负离子模式为主，正离子为辅的检测策略。QTOFMS参数优化项主要包括：毛细管电压、干燥气流速和温度、雾化气压力及碎裂电压等。其中碎裂电压直接影响被分析物的母离子在源内碰撞诱导解离，实验选择了120～420 V范围内的不同碎裂电压值，通过调节碎片电压获得丰富的碎片离子信息，帮助进行化合物鉴别和结构确证。

3.2牡丹皮中主要化学成分的鉴别与结果解析 在优化的色谱质谱条件下，牡丹皮提取液的HPLC-QTOFMS典型总离子流图见图1。笔者对主要的48个色谱峰(表1)进行鉴别，其中有17种单萜类成分、11种没食子酰类成分(鞣质)、8种酚酸类成分、7种苯乙酮类成分、4种黄酮类成分、1种三萜类成分。化合物鉴别方法如下：首先，根据TOFMS上所得到的精确分子量信息，典型的分子离子主要有[M+H]+、[M+Na]+、[M-H]-和[M+HCOO]-等，此外没食子酰类成分在负离子模式下还容易形成特征性的[M-2H]2-离子，通过MassHunter软件在5 ppm的质量偏差范围内计算其可能的元素组成，并将其与所建的数据库进行自动匹配，对牡丹皮化学成分进行初步鉴别。随后采用动态调节碎裂电压的方式对其中5对同分异构体进行鉴别，选择合适的分子离子峰或基峰进行碰撞诱导解离(CID)，通过二级质谱的裂解方式，获得化合物结构相关的碎片离子，根据离子的裂解情况并结合数据库中各化合物的化学结构，区分各同分异构体。

3.2.1同分异构体的鉴别区分 实验中发现牡丹皮提取液中含有大量的同分异构体，其中大部分是单萜类和没食子酰类成分，这与自建的牡丹皮已知化学成分数据库相符。以峰9和峰15为例，二者精确分子质量同为480.163 2，负离子模式下，其m/z为525.160 8([M+HCOO]-)，其元素组成为C23H28O11，可能是芍药苷和芍药内酯苷。仅仅利用TOF所得的各化合物的准分子离子的精确质荷比无法对其区分，根据两个化合物的对照品相对保留时间可鉴定峰9为芍药内酯苷，峰17为芍药苷。芍药内酯苷可以直接脱去一个苯甲酸，生成m/z357.1191[M-H-benzoic acid]-，再脱掉一个葡萄糖单体生成m/z195.066 0[M-H-benzoic acid-glucose]-。芍药苷能特征性地脱去相对分子质量为31的H-CH2O,得到m/z449.1934[M-H-CH2O]-,并继续脱掉一个苯甲酸生成m/z327.1076[M-H-CH2O-benzoic acid]-,再脱掉一个葡萄糖单体生成m/z165.0558[M-H-CH2O-benzoic acid-glucose]-。除此以外,两个化合物苷配基上均连接有苯甲酸，在碎片电压足够高的时候，能产生m/z121[benzoic acid-H]-。峰10和峰12，峰36和峰37，峰38和峰48采用相同策略进行同分异构体差别区分。

图1 牡丹皮样品正离子模式(A)与负离子模式(B)的HPLC-QTOF总离子流图

表1 牡丹皮提取物中主要化学成分的定性分析结果

续表1

峰13和峰17所代表的化合物的精确分子质量同为636.096 3，在负离子模式下，其质荷比分别为m/z635.088 5 [M-H]-，其元素组成为C27H23O18，与数据库中相对应的分子式为C27H24O18，可能是三没食子酰葡萄糖及其同分异构体。峰21,23和24所代表化合物的精确分子质量同为788.107 2，负离子模式下，其质荷比分别为m/z787.099 4 [M-H]-，其元素组成为C34H27O22，与数据库中相对应的分子式为C34H28O22，可能是四没食子酰葡萄糖及其同分异构体。峰30,31和32所代表化合物的精确分子质量同为1 092.129 1，负离子模式下，其质荷比分别为m/z1 091.121 3[M-H]-，其元素组成为C48H35O30，正离子模式下，其质荷比分别为m/z1115.118 9 [M+Na]+，其元素组成为C48H36O30Na，与数据库中相对应的分子式为C48H36O30，可能是六没食子酰葡萄糖及其同分异构体。以六没食子酰葡萄糖为例，说明其裂解情况。当碎片电压较低时，能产生m/z1091.123 9[M-H]-，同时产生m/z545.054 8 [M-2H]2-。当碎片电压较高时，产生一系列脱掉没食子酸或没食子酰基团的离子，包括：m/z939.110 3 [M-H-152]-，m/z769.089 5 [M-H-152-170]-，617.075 6 [M-H-152-170-152]-，599.065 6 [M-H-152-170-152]-，447.0687 [M-H-152-170-152-152]-等。从以上观察得到，化合物30,31和32为六没食子酰葡萄糖及其同分异构体。较低和较高电压的质谱图如图2所示。

4 结论

本实验采用HPLC-QTOFMS技术，结合数据库匹配和二级质谱分析，实现了对牡丹皮中主要成分的快速定性分析，共鉴定出48个主要成分，对5组同分异构体化合物进行了明确化区分。该方法快速、灵敏、准确度高，可作为牡丹皮质量控制的方法之一，同时为牡丹皮的药理学和临床药学研究提供了化学物质基础信息。

图2 较低(A)和较高(B)电压的质谱图

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