国产血竭总黄酮成分的纯化及活性成分的含量测定

2014-08-06张明媛宓鹤鸣范国荣亓云鹏第二军医大学药学院药物分析学教研室上海200433福建医科大学附属南平第一医院药学部福建南平353000

药学实践杂志 2014年1期

张明媛，宓鹤鸣,范国荣,陆峰,亓云鹏 (.第二军医大学药学院药物分析学教研室，上海 200433；2.福建医科大学附属南平第一医院药学部，福建南平 353000)

国产血竭，亦称龙血竭，为百合科植物剑叶龙血树[Dranaenacochinchinensis(Lour.) S.C.Chen]的含脂木材经提取得到的树脂，被《本草纲目》誉为“活血圣药”[1]。现代医学中用于与血瘀证相关的冠心病、心绞痛、急性心肌梗死等疾病的治疗[2-4]。研究表明，国产血竭总黄酮是其发挥活血化瘀作用的主要有效部位[5-7]，其中主要包含龙血素A、龙血素B、龙血素C等活性成分和其他杂质。只有将其进一步分离纯化，并结合药效学实验的指引，才有可能阐明国产血竭发挥活血化瘀作用的机制。大孔树脂已被广泛用于黄酮类成分等的提取和精制[8-12]，本研究采用D101型大孔树脂对国产血竭总黄酮进行分离纯化，并采用高相液相色谱(HPLC)法测定国产血竭精制总黄酮中主要活性成分龙血素A、龙血素B的含量，从而为国产血竭黄酮类成分的分析及制备提供依据，并为研究国产血竭活血化瘀的作用机制提供基础。

1 材料和仪器

1.1药材与试剂国产血竭原料药(产地：广西)由第二军医大学药学院宓鹤鸣教授提供并鉴定，龙血素A(批号111660-200402)、龙血素B(批号111558-200405)。对照品购自中国食品药品检定研究院，D101大孔树脂由天津南开大学化工厂生产。其他试剂：乙腈(色谱纯，上海强顺化学试剂有限公司)，乙醇，乙酸乙酯，冰醋酸(分析纯，上海试剂一厂)，去离子水(自制)。

1.2仪器岛津LC-10AT VP高效液相色谱仪，SPD-10A VP紫外检测器，N2000色谱数据工作站(浙江大学智达公司)，电子天平(HA-202AM)，SENCO R系列旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1国产血竭样品溶液的制备精确称取国产血竭原料药药材40 g，加8倍量乙酸乙酯回流提取两次，每次1 h，滤过，合并两次产生的滤液，减压浓缩成浸膏，60 ℃下减压干燥，得31.03 g粗粉。称取适量粗粉，加入95%乙醇至溶解，即得国产血竭样品溶液。

2.2国产血竭总黄酮成分的纯化将预处理好的湿树脂装入玻璃层析柱，将2.1项中得到的国产血竭样品溶液上柱，控制流速为1 ml/min。上样完毕，静态吸附1 h，之后依次用去离子水以及10%、30%、50%、70%和95%乙醇的顺序洗脱，并采用HPLC法对收集得到的洗脱液进行检测。结果表明，龙血素A、龙血素B集中在70%和95%的乙醇洗脱液中，将该部分洗脱液合并，并于60 ℃下挥干溶剂，即得国产血竭精制总黄酮。

2.3色谱条件及溶液制备色谱柱：Shim-Pack VP-ODS (150 mm×4.6 mm，5 μm，江苏汉邦科技有限公司)，流动相为乙腈-1%冰醋酸=(34.5:65.5)，柱温为30 ℃，检测波长为280 nm，流速为1 ml/min，进样量为20 μl。

2.3.1对照品储备液分别精密称取龙血素A、龙血素B对照品适量，置于10 ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成浓度分别为550 g/ml和1000 g/ml的龙血素A、龙血素B对照品储备液。

2.3.2供试品储备液称取“2.2项”下制备得到的国产血竭精制总黄酮5.09 g置于10 ml量瓶中，用乙腈溶解并定容，得到浓度为509 mg/ml的供试品储备液。

2.4方法学考察

2.4.1专属性考察在“2.3项”色谱条件下，龙血素A、龙血素B对照品色谱峰的保留时间分别为32.040、34.773 min，理论塔板数均>6 000，两者峰形良好且分离完全(分离度>1.5)，见图1。

图1 龙血素A、龙血素B对照品(a)及国产血竭总黄酮(b)的HPLC图

2.4.2线性关系考察精密量取龙血素A储备液适量，分别配制成浓度为11.00、13.75，27.50、55.00、110.00、275.00 g/ml的溶液；精密量取龙血素B储备液适量，分别配制成浓度为20.00、25.00、50.00、100.00、200.00、500.00 g/ml的溶液，在上述色谱条件下，分别测定待测组分的峰面积(Y)，并对浓度(C)进行回归分析，回归方程为：龙血素A:Y=35 844C+44 726，r=0.999 9；龙血素B:Y=28 533C-41 085，r=0.999 9。结果表明龙血素A在11.00～275.00 g/ml，龙血素B在20.00～500.00 g/ml浓度范围内线性关系良好。

2.4.3精密度实验取上述龙血素A对照品溶液(110.00 g/ml)、龙血素B对照品溶液(200.00 g/ml)，连续重复进样5次，在上述色谱条件下测定峰面积，龙血素A、龙血素B色谱峰峰面积的日内RSD分别为1.64%、1.40%；连续5 d重复以上实验测定其峰面积，计算日间精密度(RSD)，龙血素A、龙血素B峰面积的日间RSD分别为1.47%、2.67%，说明本法精密度良好。

2.4.4加样回收率实验取已测得含量的国产血竭精制总黄酮供试品溶液适量，分别精密加入龙血素A、龙血素B对照品溶液适量，在上述色谱条件下进行测定，计算回收率。结果表明，龙血素A、龙血素B的平均回收率分别为100.59%、98.90%，RSD分别为2.04%、2.88%(表1)。

2.4.5稳定性实验称取国产血竭精制总黄酮干燥粉末适量，精密称定。加入少量乙腈超声溶解，定容，摇匀，配制成浓度为5.10 mg/ml的溶液。分别于0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 h测定，龙血素A、龙血素B峰面积RSD分别为2.40%、2.61%，说明样品溶液在7.5 h内稳定性良好。

2.4.6国产血竭精制总黄酮中龙血素A、龙血素B的含量测定精确称取5份国产血竭精制总黄酮粉末，配制成浓度约为5.10 mg/ml的溶液，按“2.3项”下的色谱条件测定上述溶液，分别记录龙血素A、龙血素B的峰面积，并计算国产血竭精制总黄酮中龙血素A、龙血素B的含量。结果表明，龙血素A、龙血素B在国产血竭精制总黄酮中的平均含量分别为26.93 和25.53 mg/g (表2)。

表1 加样回收率实验结果(n=9)

表2 国产血竭精制总黄酮中龙血素A、龙血素B的含量

3 讨论

3.1国产血竭样品溶液的处理方法由于大孔树脂洗脱液从水相开始洗脱至有机相，故上样溶液一般用水溶解。我们曾选用去离子水溶解国产血竭总黄酮粗粉，但溶解效果不佳，制备产率低，在洗脱过程中还会发生晶体析出堵塞阀门。根据乐薇[8]的文献，笔者在pH=11.2的条件下调节上柱总黄酮浓度至3.64×10-3g/ml，溶解效果良好，但此条件需大量总黄酮样品溶液，不适用于实际操作。本实验最终采用95%乙醇溶解国产血竭总黄酮粗粉，虽然在首次洗脱时会损失部分产物，但其产率仍较用水溶解总黄酮粗粉的产率高，操作也更为简便。

3.2色谱条件的选择文献[13，14]选用270 nm或280 nm作为龙血素A、龙血素B含量测定的检测波长，笔者发现国产血竭总黄酮在280 nm处有较强吸收，故确定280 nm作为本实验的检测波长。有的文献采用35%乙腈作为流动相，但笔者发现在该条件下龙血素A、龙血素B峰不能很好分离，且存在拖尾现象；经过摸索，笔者采用乙腈-1%冰醋酸(34.5:65.5)为流动相，可使龙血素A、B两峰得到较好分离，也抑制了拖尾峰的出现。