Tet-off诱导表达Egr-1 HEK293稳定细胞株的建立和鉴定

彭琬昕，孟凡力，金洁，龚爱华

（1.江苏大学基础医学与医学技术学院生物学系，江苏镇江212013；2.南京师范大学生命科学院，江苏南京210023；3.南京医科大学基础医学院，江苏南京211166）

Tet-off诱导表达Egr-1 HEK293稳定细胞株的建立和鉴定

彭琬昕1，2，孟凡力2，3，金洁1，龚爱华1

（1.江苏大学基础医学与医学技术学院生物学系，江苏镇江212013；2.南京师范大学生命科学院，江苏南京210023；3.南京医科大学基础医学院，江苏南京211166）

目的：利用大肠埃希菌Tet-off诱导表达调控系统构建多西环素调控的稳定细胞株。方法：以pEGFPEgr-1质粒为模板，扩增含早期生长反应蛋白（early growth response-1，Egr-1）完整开放阅读框的DNA序列，经酶切后插入含四环素反应元件（tetracycline responsive element，TRE）序列的表达载体pTRE2hyg，获得重组质粒pTRE2hyg-Egr-1，将其转染293Tet-off细胞株，并用G418和多西环素筛选稳定表达Egr-1的细胞株。蛋白质印迹法检测多西环素诱导表达Egr-1情况；流式细胞术检测细胞增殖能力。结果：蛋白质印迹结果显示，外源性Egr-1蛋白表达受细胞培养液中多西环素调控，当从细胞培养液中去除多西环素后，Egr-1表达量明显升高。流式细胞检测结果显示Egr-1高表达细胞的增殖能力明显高于Egr-1低表达细胞。结论：利用Tet-off体系成功构建Egr-1诱导表达的细胞株，细胞的增殖能力受Egr-1表达水平的影响。

Tet-off调控系统；早期生长反应蛋白1；稳定细胞株；多西环素

早期生长反应蛋白1（early growth response-1，Egr-1）是具有锌指结构的核磷酸蛋白，能在多种内、外界刺激下迅速表达，例如促有丝分裂原、生长因子、紫外线照射以及损伤等［1］。目前已证实Egr-1参与胚胎发育、细胞生长增殖、分化以及凋亡等多种细胞事件，多种疾病如炎症及心血管疾病等与其异常表达相关［2－5］。因此，研究Egr-1在细胞中对下游基因的调控机制，可以为多种疾病的基因治疗提供理论靶点。本研究旨在利用Tet-off诱导调控系统建立多西环素调控Egr-1基因表达的293稳定细胞株，为研究Egr-1蛋白功能及其下游信号通路的调控机制提供一种有价值的细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料

Tet-off诱导表达系统（Clontech公司）及稳定表达Tet-off质粒的HEK293细胞系（以下称293Tet-off细胞系）由南京大学李朝军教授实验室馈赠。Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶CalⅠ、SalⅠ、CIAP碱性磷酸酶购自TaKaRa公司。DNA片段回收试剂盒、DNA片段PCR纯化试剂盒购自Axygen公司，多西环素和潮霉素B购自Calbiochem公司，一抗Egr-1和β-肌动蛋白购自Santa Cruz公司，羊抗兔HRP二抗购自武汉博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 pTRE2hyg-Egr-1引物设计和目的基因扩增

以已构建的pEGFP-Egr-1质粒为模板，扩增含Egr-1完整开放阅读框的DNA序列。上游引物序列为5′-CCATCGAT（ClaⅠ）ATGGCCGCGGCCAAGGCCGAG-3′；下游引物：5′-CGGAATTC（SalⅠ）TATGGTGGGATGGTGAGGCA-3′。反应条件：96℃5 min预变性，94℃45 s，65℃45 s，72℃120 s，循环30次，最后再72℃延伸7 min。

1.2.2 重组反应质粒pTRE2hyg-Egr-1的构建、克隆、筛选 PCR产物和含四环素反应元件（tetracycline responsive element，TRE）序列的pTRE2hyg载体使用CalⅠ和SalⅠ分步酶切，1%琼脂糖凝胶电泳割胶回收，纯化DNA。目的基因Egr-1与含相应黏性末端的pTRE2hyg连接。

反应体系10μL，含10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶1 IU，目的基因片段和载体片段按摩尔比3∶1于16℃连接反应20 h。连接产物10μL转化入100μL感受态细菌DH5α，经氨苄西林培养基筛选，重组质粒用双酶切或PCR鉴定后测序分析。

1.2.3 多西环素抑制EGR-1基因表达的最佳浓度测定 293Tet-off细胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM中，在37℃，含5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。将培养的293Tet-off细胞系接种于6孔板中，培养至细胞密度达60%～70%，按Lipofectamine 2000说明书步骤转染pTRE2hyg-Egr-1重组质粒入细胞，孵育6 h后去除含脂质体复合物的培养基，于37°C、5%CO2培养24 h后进行相关实验。

按照0，0.5，1，2，4，10，100μg／mL设定多西环素的质量浓度梯度，分别处理转染了pTRE2hyg-Egr-1质粒24 h后的293Tet-off细胞株，同时将未转染pTRE2hyg-Egr-1质粒的293Tet-off细胞作为阴性对照。药物处理48 h之后，RAPI裂解细胞，提取总蛋白。每孔蛋白上样量30μg，蛋白质印迹法检测Egr-1蛋白的表达情况，选择多西环素抑制Egr-1表达的最佳浓度。

1.2.4 稳定细胞株的筛选 将293Tet-off细胞接种至60 mm培养皿中，至密度为70%时转染pTRE2hyg-Egr-1质粒。消化细胞接种至2个10 cm细胞培养皿，用含200μg／mL G418、10%胎牛血清的DMEM继续培养。48 h后，添加潮霉素B至终质量浓度为100μg／mL，每两天换一次液，得到的稳定细胞株命名为293Tet-off-Egr-1。

2 结果

2.1 重组表达载体的构建及酶切鉴定

人Egr-1全长cDNA以正确的读码框插入表达载体pTRE2hyg中，获得重组质粒pTRE2hyg-Egr-1，质粒经ClaⅠ、SalⅠ双酶切得到约1 600 bp的片段（图1），同预期的结果相一致。挑取单个菌落送上海生工生物公司进行序列测序，结果完全正确。

图1 重组表达载体pTRE2hyg-Egr-1酶切鉴定

2.2 多西环素负调控Egr-1蛋白表达的测定

将不同质量浓度多西环素（0、0.5、1、2、4、10、100μg／mL）处理的293Tet-off-Egr-1细胞以及293Tet-off对照组细胞裂解液加入6×上样缓冲液，10%SDSPAGE电泳，转至PVDF上，检测Egr-1蛋白表达，以β-肌动蛋白作为内参。实验结果显示（图2），在80 000左右位置检测到Egr-1蛋白，培养液中未加多西环素时（0μg／mL），293Tet-off-Egr-1细胞能有效表达外源性Egr-1蛋白；随着浓度的加大，多西环素对Egr-1表达的抑制作用逐渐增强。当多西环素的浓度达到10μg／mL时，与未加多西环素处理组相比，Egr-1水平明显降低。

图2 蛋白质印迹法检测293Tet-off-Egr-1细胞中Egr-1蛋白的表达

2.3 Egr-1对细胞增殖能力的影响

利用我们建立的293Tet-off-Egr-1细胞模型检测Egr-1不同表达量情况下细胞周期的变化情况。结果显示，Egr-1高表达的293Tet-off-Egr-1细胞（0、1μg／mL多西环素处理组）S期细胞所占的比例明显高于加入了20μg／mL多西环素的细胞组（图3）。

图3 不同浓度多西环素处理后细胞周期的变化

3 讨论

Tet-off诱导表达系统是20世纪90年代以来Gossen等［6－8］利用大肠埃希菌转座子Tn10四环素抗性操纵子创建的一种高效、严密并特异地控制外源基因表达的体系。通过加入四环素或其衍生物多西环素能抑制目的基因的表达，而在去除培养基中的四环霉素或多西环素后目的基因的表达被激活［9］。随着细胞培养基中四环素或多西环素减少，外源基因表达逐渐增加，且表达按照一种剂量依赖方式受四环素或者多西环素精准调控［10］。Tet-off系统主要包括2个部分，即调节质粒和反应质粒。调节质粒可以表达一种融合蛋白，称为四环素反应转录活化因子（tTA）；反应质粒含有四环素反应元件［11］。本实验中，我们将Egr-1基因插入pTRE载体中反应原件TRE的下游，并将该重组质粒转染含有pTet-off基因的293稳定细胞株，得到受四环素及其衍生物多西环素调控Egr-1蛋白表达的稳定细胞株293Tet-off-Egr-1。

Egr-1又称NFGI-A、Zif268、Krox24和TIS8等，能被一系列生长因子、细胞因子和损伤刺激迅速而瞬时地诱导表达［12－13］。Egr-1参与多种细胞进程，其中包括血管发生、肿瘤发生、缺血应激、损伤愈合和一些血管疾病［14－15］。Egr-1在体内正常组织和细胞中表达极低，甚至不表达；而在生长活跃器官或组织的细胞中表达明显增多。已有文献报道，Egr-1通过直接或间接地参与细胞增殖、凋亡、分化等过程，在肿瘤形成和心血管、肺脏、肾脏等系统的疾病中发挥重要作用［16－17］。

本实验中我们成功构建了Tet-off基因表达系统反应质粒pTRE2hyg-Egr-1。初步结果显示，反应质粒pTRE2hyg-Egr-1转染至293Tet-off细胞后，在多西环素的存在下，Egr-1蛋白表达水平随多西环素质量浓度升高而下调。与未加多西环素处理的对照组相比，实验组Egr-1表达量明显下降。流式细胞检测结果显示，在不同浓度多西环素存在情况下，随着Egr-1表达量的不同，293Tet-off细胞的周期发生明显改变，证明该细胞株可以作为研究Egr-1对细胞行为调控作用的实验工具。

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Establishment and detection of a Tet-off stable cell line expressing Egr-1 protein regulated by doxycycline

PENGWan-xin1，2，MENG Fan-li2，3，JIN Jie1，GONG Ai-hua1
（1.Department of Biology，School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.School of life science，Nanjing Normal University，Nanjing Jiangsu 210023；3.School of Basic Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing Jiangsu 211166，China）

Objective：To construct the responsive plasmid of pTRE2hyg-Egr-1 Tet-off gene expression system and examine its expression.M ethods：PCR was performed to obtain the cDNA of early growth response-1（Egr-1）which was inserted into the responsive plasmid PTRE2hyg.DNA sequencing was performed after the recombinant of responsive plasmid pTRE2hyg-Egr-1 was identified by sequencing.This recombinant vector was transfected into 293Tet-offcells by means of liposome and its expression was examined by Western blotting under the control of deoxycycline.Results：The responsive plasmid pTRE2hyg-Egr-1 verified by sequencing，was capable of expression in 293Tet-offcould be controlled by deoxycycline concentration.Conclusion：The responsive plasmid pTRE2hyg-Egr-1 of Tet-off expression system was constructed successfully，and it can express under the regulation of deoxycycline in the 293Tet-offcells.

Tet-off inducible gene expression system；early growth response-1；stable cell line；doxycycline

R329.28

A

1671－7783（2014）02－0118－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140046

国家自然科学基金资助项目（31100964）

彭琬昕（1982—），女，安徽合肥人，讲师，主要从事肿瘤细胞生物学研究。

2014－03－04 ［编辑］陈海林