Mesothelin抗体修饰的纳米探针对人胰腺癌细胞BxPC3的体外靶向研究

卢明智 乐文俊 崔少斌 孙兵妹 陈炳地 邵成伟

间皮素(Mesothelin)在正常人体的胸膜、心包和腹膜上的间皮细胞表达。近年来的研究发现，绝大多数胰腺导管腺癌表达Mesothelin蛋白[1]，而正常胰腺组织及包括慢性胰腺炎在内的其他胰腺原发性疾病均无 Mesothelin表达[2-3]，提示Mesothelin有望成为攻克胰腺癌的分子标靶。本研究构建一种负载Mesothelin抗体的复合纳米探针，并通过体外实验评估该探针对人胰腺癌细胞BxPC3的靶向治疗效果。

材料和方法

一、荧光纳米Fe3O4@SiO2探针的合成

根据文献[4-5]报道的方法合成荧光纳米Fe3O4@SiO2探针。在氩气保护下，往回流加热反应装置中加入乙酰丙酮铁和三甘醇，缓慢加热至沸腾，回流反应8 h。自然冷却至室温，磁分离洗涤数次后即得到稳定的Fe3O4溶液。在室温机械搅拌下，向150 ml的锥形瓶中加入一定量的Fe3O4溶液、去离子水、无水乙醇和正硅酸乙酯(TEOS)，然后用氨水调节至pH值为9左右，继续反应12 h，然后磁性分离，用去离子水洗涤6次以上即获得Fe3O4@SiO2磁核。再经3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)修饰后获得氨基化的Fe3O4@SiO2磁核。

根据文献[6-7]报道的方法合成荧光量子点。在氮气保护下，3 ml去离子水中加入0.10 g硼氢化钠(NaBH4)和0.127 g碲(Te)粉，80℃下搅拌反应30 min，制备碲氢化钠(NaHTe)溶液备用。氮气保护下，在100 ml去离子水中加入0.457 g氯化镉(CdCl2)和420 μl巯基丙酸，用1 mol/L NaOH调节pH值为11～12，剧烈搅拌30 min，然后迅速加入上述新制备的NaHTe溶液，混合溶液立即变为橘红色，然后置100℃下搅拌反应7 h，异丙醇沉淀，离心后，用2 ml二次水重悬沉淀即获得在紫外激发下发红色荧光的CdTe量子点。

根据文献[8-9]报道的方法合成荧光纳米Fe3O4@SiO2探针。取0.5 ml上述量子点原液，加入50 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、50 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2 ml活化缓冲液[pH5.0的0.01 mol/L乙烷磺酸溶液(含0.05% Tween-20)]，垂直旋转反应30 min，然后加入4 mg氨基化的磁核，垂直旋转仪上反应12 h。反应结束后磁分离并去离子水洗涤3次后获得荧光纳米Fe3O4@SiO2探针。

二、Mesothelin抗体修饰的荧光纳米Fe3O4@SiO2探针的合成

取2 mg羧基化的量子点-磁珠，加入500 μl活化缓冲液，在漩涡振荡器上混合均匀，加入2.5 mg EDC和2.5 mg NHS，室温下活化反应30 min。然后用pH 9.0、0.005 mol/L的硼酸盐吐温缓冲液(含0.05%Tween-20)作耦联缓冲液，再加入0.5 ml 100 μg/ml的Mesothelin抗体，室温反应2 h，磁分离后用5% BSA进行封闭，最后将探针重悬于2 ml PBS，4℃存储备用。

三、体外靶向实验

人胰腺癌细胞BxPC3由长海医院消化科馈赠，常规培养传代。取对数生长期细胞分别与5 μl 1 mg/ml经5% BSA封闭处理后未修饰Mesothelin抗体的荧光纳米探针和Mesothelin抗体修饰的荧光纳米探针共孵育30 min；人肝癌细胞株HepG-2由同济大学生物医学工程与纳米科学研究院馈赠，常规培养传代。取对数生长期细胞与5 μl 1 mg/ml的Mesothelin抗体修饰的荧光纳米探针共孵育30 min。孵育结束后均经PBS洗涤3次，通过电荷耦合器件(CCD)荧光成像系统观察探针与细胞的吸附情况。

四、磁分离实验

取对数生长期BxPC3细胞，重悬于高糖DMEM培养液中，分别与50 μl 1 mg/ml经5%BSA封闭处理后未修饰Mesothelin抗体的荧光纳米探针、Mesothelin抗体修饰的荧光纳米探针共孵育30 min，磁分离后分别计数上清和PBS重悬后沉淀中的细胞数。以HepG-2和K562细胞作为对照。吸附效率=100%×N沉淀中细胞数/N上清和沉淀中的总细胞数。

结 果

一、荧光纳米探针的形态特征

荧光纳米探针外观呈球形，形状较规则，中心黑色的部分为电子密度较大的磁核，周围灰色的部分为无定形SiO2包裹层(图1a)。纳米探针的颗粒大小较均匀，多数流体动力粒径在120～140 nm间(图1b)。

图1 荧光纳米探针的投射电镜(a)及粒径分布(b)

二、荧光纳米探针与细胞的吸附状况

未交联抗体的探针与BxPC3、HepG-2、K562细胞的吸附效率分别为(18.8±2.7)%、(15.8±2.4)%、(16.6±2.1)%，均低于20%。交联Mesothelin抗体的探针与BxPC3、HepG-2、K562细胞的吸附效率分别为(53.9±1.8) %、(8.0±2.1)%、(8.9±2.3)%，其与BxPC3细胞的吸附能力显著提高(图2)。

图2 未交联抗体的荧光探针(上)、交联Mesothelin抗体的探针(中)与BxPC3细胞，交联Mesothelin抗体的探针与HepG-2细胞(下)共孵育后CCD荧光成像系统镜下所见(左)及其UV激发下摄片(右)

讨 论

胰腺癌是一种恶性程度较高的肿瘤，其致死率在癌症中高居第4位。由于胰腺癌发病早期缺乏典型征象，且癌细胞生长快速，大多数患者确诊时已属晚期，胰腺癌对放化疗不敏感，手术切除率仅为10%～15%。因此，胰腺癌的早期诊断对于治疗和预后具有重大意义。

纳米探针技术在生物和医学领域的研究已成为一个很有生命力的新方向。由于纳米探针易可控修饰，生物相容性好，又可赋予良好的光学性质和局域场增强效应等优势，使其在生物组织成像、癌症的诊断和治疗方面的应用研究更加广泛。本研究构建了磁性-荧光的双功能纳米探针，在其表面修饰Mesothelin抗体，结果显示经Mesothelin抗体修饰的纳米探针可定向地识别高表达Mesothelin的人胰腺癌细胞BxPC3，具有明显的靶向识别细胞受体的能力。由于正常组织的间皮细胞亦表达Mesothelin，因此，还需要通过体内实验进一步探讨该技术的安全性及应用价值。

参 考 文 献

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