液相色谱－电感耦合等离子体质谱法测定稻米中的5种砷形态

巩佳第， 曹晓林， 曹赵云， 卞英芳， 于莎莎， 陈铭学

（中国水稻研究所 农业部稻米及制品质量监督检验测试中心，浙江 杭州310006）

水稻是除饮用水以外，人体对砷摄入的最主要来源［1］。大量研究表明，稻米中砷主要以无机态的砷酸盐、亚砷酸盐，以及有机态的二甲基砷（DMA）、一甲基砷（MMA）和少量的砷甜菜碱（AsB）等形式存在［2－4］。由于无机砷的毒性高于有机砷，目前国内外仅对稻米中的无机砷限量做出规定，但研究表明，有些有机砷可能与癌细胞活性有关，也存在毒性［5－7］。因此，对稻米中各种砷形态进行全面的分析才能科学、客观地对稻米砷安全做出评价，并开展相关的风险评估工作。

在稻米砷形态分析中，如何实现对各形态完全提取，同时又要避免形态间的相互转化，是其主要的技术难点［8，9］。研究认为稻米基质中的巯基化合物（如谷胱甘肽、半胱氨酸等）在低氧化还原环境中，可将砷酸根［As（V）］部分还原为亚砷酸根［As（Ⅲ）］，而使得As（Ⅴ）测定结果偏低；若采用过强的氧化体系提取，则导致As（Ⅲ）的响应降低，甚至不能被测定［10－12］。目前，基于酸体系结合热辅助提取技术被认为是解决上述问题的有效途径，如近几年报道的硝酸热辅助提取法、甲醇－HNO3热超声浸提法、三氟乙酸微波萃取法等［13－15］。但这些技术的提取效率存在明显的差异，且酸介质对后续的色谱分离非常不利，如极易引起常规离子交换柱的柱效下降及柱压上升等。此外，在加热方式上，与本文采用的石墨消解仪相比，微波消解存在分析效率较低、分析成本较高的问题，而电热板的控温能力相对较弱。由此可见，针对稻米中5种砷形态的提取、分离方法，还有待于进一步完善和统一。

本工作采用石墨消解法提取，以耐酸较强的Dionex IonPac AS19阴离子交换柱为色谱分离材料，在对几种常用 的砷形 态 提取方法［13，14，16，17］进 行比较的基础上，对提取试剂的浓度、提取时间和提取温度等条件进行了优化，结合ICP－MS高灵敏度检测，成功地建立了稻米中5种砷形态的检测方法，方法简单、准确、耐用。

1 实验部分

1.1 仪器

1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）、X－series 2电感耦合等离子体质谱仪（ICP－MS，美国ThermoFisher公司）、PM400电子天平（瑞士 METTLER公司）、PHS－3C精密pH计（上海雷磁仪器公司）、MS3 basic漩涡振荡仪（德国IKA公司）、Cyclotec 1093旋风研磨仪（丹麦Foss公司）、KQ－800TED型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、Primo R离心机（美国 ThermoFisher公司）、DigiBlock ED－54石墨消解仪（莱伯泰科公司），Oasis MAX小柱（3 mL／60 mg，美国 Waters公司）。

1.2 试剂与材料

磷酸二氢钠、无水乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠（分析纯，Fluka），硝酸钾（分析纯，Aldrich），氢氧化钠（分析纯，ACROS），乙醇（色谱纯，Merck），三氟乙酸（TFA，纯度≥95.0%，ACS），硝酸（68%～70%，上海安谱科学仪器有限公司），甲醇（色谱纯，Merck）；实验室用水为Milli－Q高纯水。

砷标准溶液：As（V）（GBW08667）、As（Ⅲ）（GBW08666）、 AsB （GBW08670）、 MMA（GBW08668）、DMA（GBW08669）以及砷单标准储备液（1 000 mg／L）均购于国家标准物质中心。5种砷形态混合标准储备液：用纯水将5种砷形态稀释成质量浓度均为2 mg／L（以As计）的混合标准储备液，置于4℃冰箱中避光保存。砷标准工作液和混合标准工作液现用现配。

实验室稻米样品随机采购于当地农贸市场。

1.3 砷形态分析

1.3.1 样品预处理

取待测稻米样品于旋风研磨仪中粉碎，过80目筛，准确称取样品1.000 g，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL 0.3 mol／L硝酸水溶液，涡旋混匀，再置于石墨消解仪中在95℃下提取90 min。将提取液冷却至室温，在8 000r／min下离心15 min，上清液过0.22μm滤膜后，供LC－ICP－MS分析。

1.3.2 仪器条件

液相色谱条件中的流动相参考国家标准［18］；流速0.9 mL／min；进样体积20μL。阴离子保护柱IonPac AG19（50 mm×4 mm，Dionex）；阴离子分析柱IonPac AS19（250 mm×4 mm，Dionex）。

ICP－MS工作参数：功率1 224 W，辅助气流量0.8 L／min，冷却气流量12 L／min，雾化气流速0.95 L／min，采集质量数砷75，载气（氩气）纯度≥99.999%。

1.4 总砷含量的测定

总砷含量测定参照国家标准［19］。随机选取了一个稻米样品，按该方法测定，其结果为235.7 μg／kg（n＝5），用于下文中对提取方法的优化研究。

2 结果与讨论

2.1 提取试剂的选择

目前针对砷形态的提取溶剂主要有有机试剂、无机试剂以及复合试剂，另外还有酶试剂提取等［15，20－22］。比较了50%（v／v）甲醇水溶液（含1%（v／v）硝酸水溶液）、0.3 mol／L硝酸水溶液、3%（v／v）三氟乙酸（TFA）水溶液和水4种提取试剂对5种砷形态的提取效率。其中，甲醇提取法于55℃下超声30 min，提取液在6 000 r／min下离心15 min，上清液过MAX柱后上机分析；0.3 mol／L硝酸水溶液提取按1.3节样品预处理方法进行；3%三氟乙酸提取法于80℃下浸提2 h；水提取法于90℃下浸提3 h，三氟乙酸水溶液和水提取法所得提取液都以8 000 r／min离心15 min，上清液过0.22μm滤膜后上机分析。上述4种提取剂对5种砷形态的提取效果见图1。

图1 4种提取试剂对5种砷形态的提取量（n＝3）Fig.1 Extraction amounts of the five arsenic species with the four extraction reagents（n＝3）

由图1可以看出，以0.3 mol／L硝酸水溶液对总砷（这里指各形态之和）的提取量最多（232.5 μg／kg），其提取效率达98.6%；水和 TFA其次，对应的提取效率分别为93.8%和88.9%；而50%甲醇最低，提取效率仅为49.2%。其次，从各砷形态的提取量来看，总体上仍以0.3 mol／L硝酸水溶液效果最好，其中 As（Ⅴ）、MMA、DMA、As（Ⅲ）和 AsB的提 取 量 分 别 为 35.1、6.9、58.1、130.9、1.5 μg／kg，而TFA和甲醇试剂几乎不能将MMA提取出来。此外，纯水的总体提取效果虽仅次于0.3 mol／L硝酸水溶液，但对As（Ⅴ）和DMA的提取效果较差，其提取量仅为0.3 mol／L硝酸水溶液的86.3%和81.1%。综合考虑，以0.3 mol／L硝酸水溶液对稻米中砷形态的提取效果最好。

2.2 提取条件的优化

2.2.1 硝酸浓度对5种砷形态提取效率的影响

将提取温度和提取时间设为95℃和90 min，分别考察了0、0.15、0.3和0.45 mol／L硝酸水溶液对各形态砷的提取效率及形态转化的影响，提取过程按1.3.1节样品预处理方法进行，结果见图2。

图2 不同硝酸浓度下5种砷形态的提取量（n＝3）Fig.2 Extraction amounts of different concentrations of nitric acid on the five arsenic species（n＝3）

由图2可以看出，当试样采用不同浓度的硝酸提取时，其对As（Ⅲ）和AsB的提取量影响不明显，而DMA、As（V）和MMA的提取量总体上均随着硝酸浓度的增加而提高，且当硝酸浓度为0.3 mol／L时，这3种砷形态的提取量基本均达到最大，同时，总砷提取效率也达到最高（100.2%）。

从硝酸对As（V）和As（Ⅲ）的转化影响来看，只有当硝酸浓度≥0.15 mol／L时，稻米基质中还原性物质才能得到完全抑制，相应地As（V）提取量则有了明显的上升，之后便保持稳定。对于As（Ⅲ）而言，与不含硝酸的提取液相比，其在0.15 mol／L的硝酸水溶液中仅下降4%，基本不影响测定；而当硝酸浓度再增大时，则几乎不发生变化。综合考虑，选择0.3 mol／L为最佳硝酸浓度。

2.2.2 提取温度的选择

以0.3 mol／L硝酸水溶液为提取剂，提取时间设为90 min，考察了不同温度（65、75、85、95、105℃）对5种砷形态的提取效率的影响，结果见图3。

图3 不同温度下5种砷形态的提取量（n＝3）Fig.3 Extraction amounts at different temperatures of the five arsenic species（n＝3）

图3表明，随着提取温度的升高，除AsB和DMA的提取效率无明显变化外，其余3种形态砷的提取效率总体呈上升趋势。当温度提高至95℃时，5种砷形态的提取量基本均达到最大，与65℃时相比，As（Ⅲ）、As（V）和 MMA的提取量分别上升了24.4%、38.8%和73.9%，且总砷提取效率也达到最高（100.8%）。从各形态变化趋势看，As（Ⅲ）在85℃时提取量就有明显的提升且之后便趋于稳定。而对于As（V）和MMA，只有温度提高至95℃时，其提取量才有明显的上升，之后保持稳定。因此，选择最佳提取温度为95℃。

此外，还考察了提取时间对5种砷形态提取效率的影响。提取时间在30～180 min内，每隔30 min进行测定。结果发现，除提取时间少于60 min时的提取率低以外，其余时间点对稻米中各形态砷的提取效率无明显差异。为取得较好的提取效率和稳定的结果，选择提取时间为90 min。

2.3 对5种砷形态转化的考察

为进一步考察样品提取过程中砷形态是否发生转化，对空白稻米（仅As（Ⅲ）有检出，含量为1.93 μg／kg）分别进行100μg／kg的单一形态加标试验（n＝3）。按照1.3.1节的步骤进行处理，结果表明，稻米中添加As（V）后，对应的检出值为93.66 μg／kg，回收率为93.7%，并没有As（Ⅲ）及其他形态检出。同样，对As（Ⅲ）、AsB、MMA和 DMA的添加试验表明，其回收率为92.5%～98.5%，也未发现有砷形态之间相互转化的现象。以上研究结果与Huang等［9］以及 Zhang等［23］的结果相似。因此，采用0.3 mol／L的硝酸于95℃下消解1.5 h，可避免稻米中5种砷形态的相互转化。

2.4 线性范围和检出限

将5种砷形态的混合标准溶液分别配制成含AsB和 DMA0.05、0.5、5、50、200μg／L，As（Ⅲ）和MMA0.1、1、10、100、400μg／L，As（V）0.15、1.5、15、150、600μg／L的混合溶液。在最佳的仪器条件下进样测定，测定结果以各形态的质量浓度为横坐标（x，μg／L），峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到的线性方程和相关系数见表1。结果表明，目标分析物在相应的质量浓度范围内具有较好的线性关系，各分析物标准曲线的相关系数不低于0.999 9。

取5种砷形态的混合标准溶液，按确定的方法测定，以不低于3倍信噪比（S／N≥3）确定方法的检出限（LOD），以S／N≥10确定方法的定量限（LOQ）。结果如表1所示，5种砷形态的LOD为0.15～0.45μg／kg，LOQ为0.50～1.50μg／kg。

表1 5种砷形态的线性范围、线性方程、相关系数（r）、检出限（LOD）与定量限（LOQ）Table 1 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients（r），limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of the five arsenic species

2.5 方法的准确度和精密度

本工作分别通过国家大米标准物质（GBW10010）结合加标回收方式考察方法准确度和精密度。由表2可看出，本方法对大米标准物质中各形态之和（Sum）的测定结果为99.15μg／kg，与其标准值（102±8）μg／kg基本一致。

表2 GBW10010中5种砷形态含量和相对标准偏差（n＝5）Table 2 Contents and RSDs of the five arsenic species in GBW10010（n＝5）

本工作在粉碎的大米中加入5、50μg／kg的AsB和 DMA，10、100μg／kg的 As（Ⅲ）和 MMA，15、150μg／kg的As（V），按照1.3.1节的步骤进行处理，分别测定5种砷形态的回收率及其精密度，结果见表3。结果表明，在2个加标水平上，各形态的回收率为89.6%～99.5%，RSD 为0.6%～3.6%。两种验证结果表明，该方法回收率高，结果稳定可靠。

2.6 实际样品测定

利用建立的方法对市场上15份稻米样品进行了测定（n＝3），结果如表4所示：15份样品中无机砷（iAs，As（Ⅲ）与As（V）之和）的含量均低于限量值（200μg／kg），全部符合我国食品卫生标准［5］。从各形态的检测结果看，稻米中砷主要以As（Ⅲ）形式存在，对应的含量为35.96～150.83μg／kg；其次为DMA和 As（V），对应的含量分别为5.24～98.13 μg／kg和4.18～13.63μg／kg；仅13号样品中检出少量的AsB，其含量为0.61μg／kg。

表3 大米基质中5种砷形态的加标回收率和相对标准偏差（n＝5）Table 3 Recoveries and RSDs of the five arsenic species spiked in rice（n＝5）

表4 稻米样品中5种砷形态的测定结果（n＝3）Table 4 Results of the five arsenic species in rice samples（n＝3） μg／kg

5种砷形态混合标准溶液（10μg／L）的色谱图见图4，两个大米实际样品（15号和13号）的色谱图见图5。从这些色谱图中可以看出，采用所建立的样品预处理方法及仪器条件，5种砷形态均得到基线分离，且峰形良好、灵敏度较高，说明该方法能满足稻米中砷形态分析的要求。

图4 5种砷形态的混合标准溶液的LC－ICP－MS色谱图Fig.4 LC－ICP－MS chromatogram of the mixture of the five standards of arsenic species

图5 15号和13号大米样品中5种砷形态的 LC－ICP－MS色谱图Fig.5 LC－ICP－MS chromatograms of the five arsenic species in rice samples No.15 and No.13

3 结论

以0.3 mol／L硝酸水溶液为提取剂，基于石墨消解仪控温提取，解决了目前对稻米中5种砷形态提取效率低、各形态间易转化的难题。结果表明，该提取方法回收率高、操作简单，尤其适合于高通量分析。此外，本研究采用Dionex IonPac AS19阴离子交换柱对5种砷形态进行分离和ICP－MS检测，极大地提高了方法的耐用性和分析灵敏度。由此可见，本方法适合于稻米中5种砷形态的准确定性、定量分析。

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