低温诱导植物染色体加倍实验的探究与改进*

杜 瑛,郭 凯

(包头师范学院 生物科学与技术学院,内蒙古 包头 014030)

随着中学生物实施课程改革，从2009年按开始，内蒙古自治区高中生物教材从以前选用人教版全日制普通高中生物教材改为选用人教版新课程标准实验教科用书。《高中生物课程标准》(以下简称《新课标》)尊重学生多样化发展的新需求，更贴近实际和生活经验，更重视发展学生的实践能力。《新课标》中明确指出要倡导探究性学习，要让学生勤于动手。

与过去的教材相比，《新课标》中生物实验的比重明显增加，有些实验是以前教材不要求的，低温诱导染色体加倍实验便是其中之一。实验教学属于必需亲自操作后才能有深刻体会的教学内容，有的实验如果单单照搬教科书上的过程，在实际操作中会遇到许多问题，会对教学效果产生不利影响。因此，对于《新课标》中涉及的实验内容，实验教师要提前感受为好。

面对中学生物《新课标》实施的现实，大学实验课程教学中要有适当的体现，要使生物教育专业的本科毕业生所获得的实践技能能够贴近《新课标》的要求。目前，我校生物教育专业的本科实验教学内容中还没有低温诱导染色体加倍实验的项目，为了促进教学改革，为今后实验项目设计提供帮助，特开展了本实验的研究，以期找到能体现最佳实验效果的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验中分别选择了洋葱(Alliumcepa)、大蒜(AlliumpallasiiMurray.) 做为实验材料。大蒜生根前放入4℃冰箱1d以打破休眠期，提高出根率。[1]试验时选取健壮的大蒜瓣，剥去蒜皮，共20枚，每5枚大蒜为一组用细木棍穿起来放入盛有清水的容器中(见图1-1) 进行室温培养。水以浸没根部为宜，每两天换一次水，根尖3d长到约1cm长，此时将装置转入4℃的冰箱里进行低温诱导。洋葱的培养方法为选取健壮洋葱放入盛有清水容器中，水以没过洋葱根部为宜，每两天换一次水，室温培养。(见图1-2)

1.2 材料处理与方法

1.2.1实验材料的固定

固定是借助于物理方法或化学药物的作用，迅速渗入组织和细胞将之杀死，使其形态结构和内含物尽可能地保持生活时的真实状态，本实验用的固定液是卡诺氏液(无水酒精：冰醋酸=3:1)。根据《高中人教版生物必修二》中低温诱导染色体数目变化的实验[2](以下简称教材)进行实验操作，低温诱导完成后，取约1cm长的根尖(教材上要求取0.5cm，但根尖应取得稍微长一点，便于从溶液中取放，可以在染色时再截至适宜长度)，将其放入卡诺氏液中浸泡，教材上要求浸泡0.5-1h，但在实验中发现用卡诺氏液浸泡根尖0.5h为最佳，因为洋葱根尖比较细，卡诺氏液本身有杀死细胞的作用，如果固定的时间过长，根尖容易发黄萎蔫，不利于对材料进行观察；另外，固定根尖0.5h时根尖细胞的分散程度以及固定程度比较好。

图1-1：大蒜根尖的培养 图1-2：洋葱根尖的培养

1.2.2解离

解离是为了除去细胞间的果胶以使细胞壁软化，从而使细胞在压片时更易分散；此外还可使细胞相互分离开，防止重叠现象的发生，便于观察细胞中的染色体数目变化[3]。所以，适当延长解离时间可以让细胞的分开程度加大。在本实验的改进中关键是对解离时间的把握。教材上要求用解离液(质量分数15%盐酸：体积分数95%酒精=1:1)在室温下解离3-5min，实验发现对根尖解离10min最佳。根尖刚开始解离2min，根尖部位开始发白膨大，5min后进行染色制片发现根尖不易被捣碎，不能被敲散成雾状，更不易被充分染色，细胞重叠度较大。解离10min后根尖解离达到最佳状态，染色的时候可以被捣碎，从而充分染色，并且在制片的时候，盖玻片盖下的同时根尖就分散开来，且保持根尖形状不变，更容易找到分生区细胞。

1.2.3漂洗

教材中提到用清水漂洗，但是本实验的漂洗最好用蒸馏水,除了洗去解离液防止解离过度外，也可起到低渗作用，使细胞体积有一定的膨胀，便于以后染色体形态的观察.根尖材料要漂洗三遍，每遍2-3min，注意动作要轻，不要弄坏了根尖形态。

1.2.4染色

教材上采用龙胆紫染色或醋酸洋红染色，但是实验发现，用醋酸洋红染液进行制片染色效果更佳，龙胆紫染色不清晰。而醋酸洋红染液是一种细胞核染液，可以使染色体部分染色较深，而细胞质部分基本不染色，染出的装片细胞核明显，便于观察。(见图2-1、图2-2)

图2-1：40倍物镜下龙胆紫根尖染色 图2-2：40倍物镜下醋酸洋红根尖染色

在取材方面，教材上是把根尖浸泡入玻璃皿中染色3-5min，这样操作材料染色过深，反而不利于实验的观察，另外根尖经过解离已经变得酥软，如果此时放入染液不容易把根尖完整地取出。为了避免染色过深和对根尖材料的损伤，实验参照林荔等的研究结果进行了改动[4]：在载玻片中央滴一滴清水，用镊子夹起解离、漂洗后的根尖材料放于清水里，用刀片把根尖材料切到合适长度，约5mm，再滴加一滴醋酸洋红染液，用镊子将根尖轻轻捣碎细胞完全分散。这样，不仅核内染色体易被染色，且缩短了染色时间，染色3min，接着再进行制片。

1.2.5制片

在盖玻片上铺吸水纸，以手按压，注意力度，防止盖玻片滑动，再以吸水纸在盖玻片四周把水和染液吸干，吸干水后用镊子钝头轻轻敲打盖玻片下的材料，使材料雾状均匀分散，便于观察。教材中以盖玻片上加盖载玻片的方法按压，玻片易滑动，不容易操作。制片结束后，用高倍镜观察细胞染色体情况。

2 实验结果

2.1 洋葱和大蒜实验效果比较

文献资料显示，在低温诱导染色体加倍实验这一实验中，与大蒜相比，洋葱根尖细胞分裂相旺盛期持续时间短且不明显[5]。根据实验结果来看(图3-1，图3-1)，实验制片观察洋葱与大蒜染色体效果差别不是很明显。

图3-1：洋葱根尖 图3-2：大葱根尖

2.2 大蒜根尖在低温条件下不同处理时间的实验结果

实验在4℃低温下分别对大蒜进行36h、48h、72h的染色体变异诱导，然后再室温培养24h，随后镜检实验效果。结果(图4.1-图4.3)显示：经过镜检三种处理均没有发现染色体加倍的细胞。虽然如此，发现低温诱导72h处理后，根尖细胞处于分裂期的细胞多。

图4-1:低温诱导36h处理的镜检图 图4-2:低温诱导48h处理的镜检图 图4-3:低温诱导72h处理的镜检图

3 讨论与分析

从染色效果看，洋葱与大蒜染色体效果差别不大，表明二者均是观察染色体染色的良好材料。通过比较大蒜和洋葱的根尖细胞发现，由于洋葱根尖细胞分裂相旺盛期持续时间短，使用大蒜观察效果较好。由于低温诱导染色体变异机制是抑制了纺锤体的作用，因此，细胞分裂约旺盛实验越容易成功。因此，总体来说，大蒜对于低温诱导染色体变异实验项目来说是更可取的。

对于诱导染色体变异来说，常用秋水仙素和低温诱导。但是，由于秋水仙素有剧毒，不易用于中学生物实验，故此本次实验探究用低温诱导染色体变异的最佳条件。低温处理虽然效果欠佳，但具有易操作、安全、成本低等诱导。

本次实验虽然设置了不同时间的低温处理，但结果并未观察到染色体加倍现象。这一则可能与低温诱导效率低，且由于实验时间紧未能反复进行大量实验有关；另一方面也可能与处理温度不适合有关，张兴莲等研究认为诱导染色体变异的温度在2℃到4℃范围内更佳[6]。但是，实验室目前冰箱不具有2-4℃的调温功能。此外，多倍体难以观察也是实验不易成功的原因之一，观察染色体的最佳时期是分裂中期，而低温诱导染色体加倍的机制是抑制纺锤体的作用而阻碍细胞有丝分裂一分为二，发生染色体加倍的细胞必须是染色体已复制的细胞[7]，只有当该细胞进入到下一个分裂周期的中期或后期时才能确保观察到结果，而低温降低酶的活性，细胞分裂速度受限[8],结果不易观察。

从诱导时间上来看，虽然本次实验未能观察到染色体加倍现象，但诱导72h的处理细胞分裂旺盛。由于低温诱导的染色体加倍发生在细胞分裂期，分裂旺盛暗示72h处理与36h和48h相比是更合适的处理。

4 结论

本课题就高中生物学新课程“低温诱导植物染色体数目的变化”实验提出了一些细节上的补充，并通过在培养、取材、固定、解离、染色、漂洗等常规实验步骤做了更详细的处理，以提高实验的成功率，提高实验结果观察的可行性和可靠性，来保证实验教学的顺利进行。在低温诱导方面采取了2-4℃的低温，低温诱导时间为72h时实验效果最佳。本课题值得探讨的地方还有很多，应该进行对诱导最适温度和时间的精确测量，以增加诱导植物染色体加倍的成功率。

〔参考文献〕

[1]张明清,林荔,肖义军. 对“低温诱导植物染色体数目的变化”实验细节上的补充[J].生物学通报, 2011, 46(9):56-57.

[2]朱正威. 高中人教版生物必修二[M].北京：人民教育出版社, 2007：88-89.

[3]郁建强, 陆文初. 植物细胞有丝分裂实验技术的改进[J].实验室研究与探索,2001,(06).

[4]林荔,肖义军,詹晓梅. 低温诱导植物染色体数目变化实验的改进[J].中学生物学,2012,28(1):51-52.

[5]王晓雯,桑贤春. 一种高效的蚕豆染色体加倍方法探讨[J].河南农业科学,2013,42(6):42-45.

[6]张兴莲,潘宁. “低温诱导植物染色体数目变化”的实验探究[J].中学生物教学,2011,(7):45-46.

[7]潘明山,谢启燕. “低温诱导植物染色体数目变化”的改进与分析[J].福建基础教育研究,2014,(02):128-129.

[8]李爱玲, 嘉建斌. 大蒜根尖细胞有丝分裂周期性研究[J].榆林学院学报,2008.