固态发酵生产蛋白饲料的研究进展

谢普军, 黄立新*, 张彩虹, 游 凤, 张耀雷

(1.中国林业科学研究院 林业新技术研究所, 北京 100091； 2.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室, 江苏 南京 210042)

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固态发酵生产蛋白饲料的研究进展

谢普军1,2, 黄立新1,2*, 张彩虹1,2, 游 凤1,2, 张耀雷1,2

(1.中国林业科学研究院 林业新技术研究所, 北京 100091； 2.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室, 江苏 南京 210042)

介绍了国内外固态发酵技术制备蛋白饲料的研究进展，主要从固态发酵的优缺点和影响发酵工艺的主要因素包括固态发酵基质的类别、菌种的选择及固态发酵过程中工艺参数的影响进行阐述，并对固态发酵过程中存在的问题与关键技术进行了展望，以期为农林废弃物深加工提供参考。

固态发酵；工艺参数；蛋白饲料；研究进展

随着全球人口的增长和人民生活水平的提高，人民对优质高蛋白食物的需求量增加，从而刺激了养殖业的发展，但在养殖业发展的过程中，对饲料业的依赖与日俱增，据统计我国蛋白饲料的供不应求，还将主要通过进口解决，预计到2030年我国蛋白饲料的缺口将达到2 790万吨[1]，因此，急需增加蛋白饲料的产量，缓解我国蛋白饲料紧张的局面。饲料业是连接种植业和养殖业的纽带，是该产业链的核心[2]，而种植业在加工产品的过程中，往往会产生大量的农林废弃物，如玉米秆、甘蔗渣、苹果渣等，这些废弃物往往是直接扔掉，喂食动物或者直接燃烧作为能源，不仅造成环境污染，而且是资源的极大浪费。

全世界因加工农业原材料生产食品而产生工农业废弃物的量是巨大的，据统计我国每年产生的农林废弃物达15亿吨[3]，这些被丢弃的废弃物反过来又会增加环境的生化需氧量(BOD)负担。来自加工蔗糖、橘子，咖啡，稻谷等农林废弃物，原本通过微生物作用可以转化成一些精细化学品如生物酶类等，此应用可显著提高原料的经济附加值[4]被视为废弃物。其实这些废弃物中含有许多动物所需的重要营养物质如淀粉、脂类、蛋白质等，可以直接作为动物饲料的主体部分，但是由于这些物质中往往含有一些抗营养因子如单宁、棉酚、植酸和草酸[5-7]等存在而导致动物对营养物质的消化吸收出现问题。此问题实际上可通过固态发酵可以使受到抗营养因子干扰或这些未被利用的营养物质经过动物喂养得到充分的利用[8]，同时还可以在合适的条件下显著提高蛋白质的含量。利用固态发酵技术对农林废弃物进行营养转化、富集及脱毒处理，生产为动物养殖业提供高蛋白生物饲料来源，不仅促进我过畜牧业发展，缓解我国饲料蛋白的紧张局面，而且对环境保护起着重要影响。

本文作者主要从固态发酵的优缺点和影响发酵工艺的主要因素包括固态发酵基质的类别、菌种的选择及固态发酵过程中工艺参数的影响进行阐述，并对固态发酵生产蛋白饲料过程中存在的问题及关键技术进行了展望，以期为固态发酵制备生物饲料工业化提供数据与理论的借鉴。

1 固态发酵定义及优缺点

固态发酵(solid state fermentation，SSF)是指在培养基呈固态，虽然含水丰富，但没有或几乎没有自由流动水的状态下进行的一种或多种微生物发酵过程，底物(基质)是不溶于水的物质，它不仅可以提供微生物所需碳源、氮源、无机盐、水及其它营养物，还是微生物生长的场所[9-10]。固态发酵可以通过微生物作用将农林废弃物中蛋白含量低或不利于动物消化吸收的物质转化为营养价值、利用率高的动物饲料。与常规的液体深层发酵相比，SSF的优缺点包括[11-12]： 1)对发酵的底物水分含量要求不高，从而降低了细菌和真菌的污染； 2) 提供更高的通气量，更利于有氧固态发酵的效率； 3) 提供真菌天然相似的场所，更利于真菌生长发酵； 4) 固态发酵的基质一般为农林废弃物，基本能满足微生物的生长，因此，培养基要求低，且是利于资源有效利用和环境保护的途径之一； 5) SSF反应装置简单，空间需求小； 6) 固态发酵通常伴随着低能耗，因为工业级固态发酵如高温高压灭菌或者蒸汽预处理，机械搅拌和通气等处理在一些固态发酵过程中往往是不必要的； 7) “三废”的排放量通常很小，因为产品浓度高且对于产品的萃取只需很少的溶剂； 8) 低湿度的特征可能会产生液态发酵过程中不能获得或产量很小的一些特殊产物； 9) 有一些SSF的终产物更易于处理，如农林废弃物的发酵蛋白饲料可直接进行烘干。当然，SSF技术也存在一些不足： 1) 样品经常需要预处理如粉碎、物理、化学或酶水解处理、蒸煮或蒸汽处理； 2) 在固态发酵过程中如涉及到细菌发酵，往往要求湿度高，而恰与真菌低湿度要求相冲突，具体的发酵情况需要具体分析，一般情况下都是选择高效率的低湿度真菌固态发酵； 3) 生物量比较难以确定； 4) SSF过程中工艺参数如pH值、基质湿度、氧和生物质浓度难以精确控制； 5) SSF往往都是静态发酵(动态发酵难以控制)，导致菌种与基质接触不充分； 6) SSF技术由于缺乏放大过程的设计和操作的一些重要信息，使一些应用于工业的固态发酵反应装置还不成熟； 7)容易导致一些真菌的污染； 8)通气可能会由于SSF的高浓度黏性固体基质而变得困难； 9)SSF技术发酵时间长且发酵过程产生的余热可能对微生物的发酵不利。

2 固态发酵基质的影响

固态发酵过程对发酵基质无特殊要求，一般都富含淀粉、蛋白质、纤维素、矿物质等能直接或间接满足微生物生长的一些必需营养物质，但也含有许多不利于动物消化吸收的抗营养因子，如植酸、单宁等。据文献报道[13-16]，研究固态发酵蛋白饲料的基质主要有棉籽饼、苹果渣、豆粕渣、马铃薯渣、芒果渣、米糠等农林废弃的糟渣或下脚料，实际上这些废弃物都可以利用微生物的发酵作用，不仅提高蛋白质含量，也能降低这些物质中的抗营养物质，从而提高农林废弃物的附加值。

2.1 发酵底物物化形态的影响

对发酵基质往往需要考虑主要化学成分含量及物理形态如底物颗粒大小、孔隙率等，这其中底物颗粒形状大小是首先需要考虑的，底物颗粒越小，增加了微生物与底物的接触面积，提高了发酵效率；然而，并非发酵基质的颗粒越小越好，当基质的颗粒越小，底物的比表面积增大，同时也增加了它们之间的吸附力，容易产生抱团，凝结在一块，反而不利于微生物的有效利用，同时也增加了传质传热的阻力，因此，如想提高固态发酵的效率，则需要选择恰当的原料颗粒大小[17]。

2. 2 抗营养因子的影响

应用于固态发酵的原料基本上都来自农林废弃物，而这些原料通常含有普遍抗营养因子如植酸、单宁、棉籽酚、草酸、消化酶抑制剂、绿原酸等[18]，这些化合物在不同程度上会影响到动物对饲料的消化吸收。为进一步说明动物抗营养物质的害处，叙述如下。

2.2.1 植酸 植酸是植物中普遍存在，尤其在豆类和含油的种子如黄豆、油菜籽和棉籽中。62%～73%谷类的总磷以有机植酸磷形式存在，豆科种子内总磷的46%～73%以有机植酸磷的形式存在[19-20]。除此之外，植酸具有很强的螯合性，同时也会螯合钙、镁和锌等必需矿质元素及蛋白质。对于单胃动物喂食这类含植酸的物质会因其体内缺乏相关植酸酶而不能吸收利用，易导致磷和其他矿质元素的缺乏，从而使蛋白质和相关矿质元素的生物效价降低，不利于动物的健康成长。因此，对于上述问题一般通过向动物粮食饲料直接加入少量植酸酶以释放动物所需的必需矿质元素和营养物质，或通过微生物如黑曲霉或枯草芽孢杆菌等对粮食饲料进行固态发酵产生植酸酶[21]，来解决矿质元素及蛋白质生物效价低的问题。

2.2.2 单宁 单宁是一类分子量超过500的可溶于水的酚类物质，能在水溶液中与蛋白质结合产生沉淀而使蛋白质的利用率降低，它同时会干扰动物消化系统中的一些消化酶、维生素B12和铁元素的吸收[22-23]。单宁虽然可以通过高温降解，但同时也会破坏粗饲料中的营养物质。通过一些产单宁酸酶的微生物如黑曲霉和柠檬酸杆菌、青霉菌等固态发酵能有效解决这一问题[24-25]。

2.2.3 棉籽酚 棉籽酚主要存在于棉籽中含量约0.4%～2.4%，对动物的生长、发育及繁殖产生不利影响[26]，用棉籽喂养动物时需将其除去，通过复合菌种(乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌)固态发酵可显著降低棉籽中棉籽酚的含量[27]。

2.2.4 草酸 与植酸类似，具有很强的螯合作用，易影响钙和镁代谢，形成草酸钙和镁不溶性盐，影响动物对钙和镁等矿质元素的吸收利用，草酸也能与蛋白质形成复合物，对单胃动物的消化产生不良影响[28]。如生产过程中存在这种问题，可以考虑加入一种称为盾壳霉(Coniothyriumminitans)的真菌，进而有效降解基质中的草酸，并且能抑制有害菌如核盘菌的生长[29]，从而提高发酵效率。

2.2.5 蛋白酶抑制剂 蛋白酶抑制剂如绿原酸，在向日葵饼中含量较高，一种类似单宁作用的物质能影响动物消化系统中的的胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等[30]。然而在广泛的微生物种类中存在着能降解绿原酸的微生物如芽孢菌(Bacillussp.Xy), 它可以显著降低绿原酸的含量[31]。因此，可以考虑选择此类芽孢菌以解决含有绿原酸发酵底物的问题。

3 菌种的选择

固态发酵蛋白饲料的菌种包括细菌(枯草杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、乳酸球菌、芽孢杆菌等)、霉菌(曲霉、木霉、根霉等)和酵母菌(热带假丝酵母、产朊假丝酵母、酿酒酵母等)，如表1所示。以固态发酵技术选择单菌种为例，单菌种的选择通常是以产高活力纤维素酶的黑曲霉作为应用最广泛的发酵菌种之一，因固态发酵的底物通常都含有大量的纤维素。而酵母菌以产朊假丝酵母和酿酒酵母使用较为广泛，其原因包括自身具有含量很高的蛋白质，同时又易于与其他菌种协同发酵。至于细菌，以植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌应用较为普遍，因其次级代谢产物(乳杆菌素和枯草菌素等)具有明显抑制固态发酵过程的有害微生物作用而利于固态发酵蛋白饲料的品质提升[32-33]。实际上，由于多菌种发酵有利于各菌种协同作用于固态基质，往往比单独菌种作用效果更明显，使之成为当前应用前景广阔且研究的热点。例如以黑曲霉与产朊假丝酵母混菌固态发酵水生植物提高产物蛋白质含量为例，实验结果显示[34]，黑曲霉与产朊假丝酵母(1 ∶1,v/v)混菌发酵蛋白质产率，较其中单一菌种得到明显提高，其原因就是黑曲霉先分泌纤维素酶降解基质中的纤维素转化成寡糖和单糖，而产朊假丝酵母可以进一步将基质转换的糖类作为碳源而进一步生长代谢发酵，从而进一步提高了固态发酵效率。因此，如今选择的菌株已趋向于多菌种混合发酵，霉菌、酵母菌的组合发酵多见报道，这是由于霉菌分解淀粉、纤维素的能力强，可降解饲料中的结构性碳水化合物。将淀粉和纤维素降解为酵母能利用的单糖、双糖等简单糖类物质，使酵母得以良好地生长繁殖，从而提高产品的蛋白质含量和营养功能。这样既减轻了产物抑制效应，又促进了酵母的生长。提高了发酵效率。

常用的固态发酵菌种包括细菌、酵母菌和真菌, 它们可以在废渣的固态基质里良好生长[35]，因此可以广泛应用于固态发酵过程。细菌主要涉及到堆肥，青贮发酵及一些食品加工过程。酵母菌可以用来生产乙醇，食品和饲料。然而，丝状真菌是一类最重要的应用于固态发酵过程的菌种，由于它们的生理，酶学和生化特性，由于真菌菌丝的生长方式的特点和良好的耐固态基质中的低水分活度和高渗透压环境，使其在天然微生物种类中，生物转化固态基质是非常有效和极具竞争力的。通过真菌发酵可以获得更好的营养价值的产品，如降解粗大豆中抗营养的化合物(植酸、凝血素等)。丝状真菌独特的菌丝生长模式可以不断从低端向上延伸并产生新的菌丝，并且能渗入到固态基质中。细胞壁粘结着顶端和菌丝分支确保它的稳固结构。菌丝顶端会分泌水解酶且不会大量稀释，不会像液态发酵分泌的酶将大量稀释，水解酶作用更强且渗入到大多数的固态基质中而发挥作用。因此，丝状真菌往往是固态发酵的最佳适宜菌种之一，并且也是固态发酵研究的热点菌种之一。

4 固态发酵过程中工艺参数的影响

对于固态发酵过程是否能够获得成功，除了选择良好的发酵基质和菌种外，对其发酵过程中工艺参数的控制显得尤为重要。因为不同微生物都有其自己最适宜的生长环境，而固态发酵过程正是通过微生物利用基质中的营养物质使其能高效生长，同时能转化为某些高营养物质如蛋白质或降解某些不利于动物消化吸收的物质如纤维素和单宁等。因此，有效控制微生物在固态基质的生长代谢，就能有效控制固态发酵过程，达到既定的目标。常用细菌、酵母菌和霉菌以及它们之间混合菌固态发酵工艺参数见表1。由表1可知，所用的发酵基质基本都来自农林加工废弃物，细菌、酵母菌和霉菌是固态发酵常用菌种，但霉菌及酵母菌应用更广泛。发酵菌种对湿度一般要求在50%～95%，湿度较低会导致发酵时间的延长和效率低。通常菌种的接种量也有所差异，一般情况下，细菌1%～5%，酵母菌5%～10%，霉菌7%～15%。发酵菌种的接种量通常取10%比较合适。发酵的温度一般在25～30 ℃，发酵时间有2～5 d较佳，一般pH值通常在7左右。在恰当的固态发酵条件下，对固态基质发酵前后蛋白含量提高的幅度最高可达约4倍。现对固态发酵工艺参数的影响叙述如下。

4.1 水分

固态发酵基质含水量与水分活度有关，维持微生物发酵过程需要一定量的水分，是整个固态发酵过程成败的关键，因为它直接影响到微生物的生长，还影响到基质物料的物理状态，营养物质的扩散、吸收等，也会对传质传热产生一定影响。湿度过高使基质通透性降低，阻碍氧气的渗入，而湿度过低可能导致传质不充分，从而影响微生物生长代谢所需营养的摄取。对发酵过程水量的控制应该基于发酵基质物料本身含水量以及微生物发酵过程的需求。发酵过程往往是微生物代谢旺盛，消耗一部分水的同时，产生的热也会使水量减少，因此，需要在发酵过程中注意对水分的补充，可以通过增加微生物发酵环境湿度，如超声雾化无菌水。

4.2 温度

固态发酵过程由微生物代谢而产生大量的热，容易影响微生物发酵过程，因此，对温度的控制也是固态发酵过程很重要的一个方面。可以通过薄层发酵或培养，底部通风等保持一定的温度。

4.3 pH值

固态发酵由于几乎不含有自由流动的水，pH值难以检测及控制。一般考基质良好的缓冲力进行自然控制，基质发酵加入一些酸碱缓冲液维持发酵过程的pH值相对稳定，使固态发酵过程能够有效持续进行。

4.4 通气量

固态发酵所使用的菌种大部分是好氧型的，通气量多少主要是由菌种的特性、合成产物时的需氧程度、基质厚度、二氧化碳生成量等。二氧化碳及其他气体的浓度对发酵或培养的影响很大，二氧化碳浓度过高会抑制微生物的代谢，进而影响目标产物的生成。由于现成的曝气技术控制还不完善，现如今研究的主要方面是通过自然曝气控制，因此，通气量没列在表1中，代表是自然条件通气。

4.5 接种量

接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成，而且会过多移入代谢废物，也不经济，过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。

4.6 发酵时间

与液体发酵相比，固态发酵的时间一般都相对较长，少则2～3 d，多则1～2 w。

表1 常用菌株固态发酵过程优化工艺参数

1)自然值：发酵过程中pH值为自然值 natural value expresses a natural pH value during the fermentation process

2)a：发酵后 means protein content of the product after fermentation; b：发酵前 means protein content of raw material

5 存在的问题与展望

生产发酵蛋白饲料大多是从农林废弃物经微生物转化而来，微生物在这一过程中扮演着非常重要的角色，对菌种的发酵效力要求很高。因为通过固态发酵生产的饲料蛋白主要包含3部分，分别是基质本身含有的蛋白质，微生物将基质中碳或氮源等转化的蛋白质及微生物自身含有的蛋白质。菌种对发酵效率起着非常重要的作用，需要对发酵菌种进行筛选。可以通过自然环境筛选，人工诱变筛选或基因工程技术对菌种改造，达到获得高效力的发酵菌种。此外，在固态发酵过程中，尤其是放大实验，往往伴随着大量热的产生，会影响微生物生长代谢，进而影响发酵蛋白饲料的质量，这是固态发酵技术实现产业化的主要瓶颈。因此，如何控制固态发酵过程产生的热量聚集而使体系过热是生产发酵蛋白饲料产业化需要解决的关键技术。解决这一问题，可以通过对固态发酵生物反应器进行有效降温设计来解决，有效控制发酵过程产生的热量。固态发酵反应器的设计主要包括托盘式、填充床、流化床和卧式滚筒等，但截止目前，所设计的固态发酵生物反应器都没能有效解决发酵过程的散热问题。当然，所设计的发酵反应器需保证使基质层间传热传质充分，在没有损坏微生物和基质床颗粒前提下，菌种与基质需充分接触混合，还要求能在线监测一些关键参数如pH值及湿度等，而这些要求都是至今难以解决的问题，更何况实现固态发酵技术的产业化。

通过模拟固态发酵过程，模拟微生物生长代谢过程及热量的变化，便于有效设计固态发酵生物反应器，从而解决发酵过程热量释放的问题。过去几年固态发酵蛋白饲料技术有了显著的发展，所涉及的方面包括动力学、数学模拟，生物反应器设计和固态发酵过程高级控制系统。对固态发酵技术模拟的研究是对放大实验研究的非常好的工具，但经模拟后的结果需要实验进一步验证。另外，固态发酵模拟的重要性在于其任何化学或生化过程不能实现的参数在模拟条件下都能实现参数值的建立。关于固态发酵模拟的研究主要集中在以下4个方面的问题：1)微生物活性的表现(动力学类型和热动力学)； 2)固态发酵过程传质传热问题； 3)以上两个系统之间的联系； 4)发酵类型的最佳选择。

6 结 语

全球每年因农林加工产生大量的废弃物，找到一种有效方法对这些废弃物进行再生利用。固态发酵的实用性、低成本、产物附加值高、环境友好等特点，利用固态发酵技术可以有效加工成生物蛋白饲料，有利于扩大蛋白饲料来源，降低养殖成本，具有保护环境等经济环保意义。固态发酵的不同经济应用将潜在地显著提高和改善人们的生活水平。除了传统的发酵食品(如豆豉和醋)外，当然也应用于高附加值化合物的生产(如酶、有机酸、生物农药、生物燃料和香味化合物)[47]。虽然固体发酵研究和应用程度较为广泛，但研究的程度不如液体发酵成熟，固态发酵过程复杂且机理尚不清晰明了，有些工艺参数控制如通气量等不能精确控制等缺陷，发酵模型也没有取得重大突破等，但并不妨碍它成为现代发酵技术的革命，打破液体发酵单一的局面。因此，通过分析，笔者认为通过固态发酵技术使农林加工废弃物转化为营养价值高的高蛋白含量生物饲料，有利于扩大蛋白饲料来源，控制养殖成本，为养殖农民增收和保护环境等方面具有非常重要的意义，同时也是我国实现资源循环利用和循环经济计划的一项重要举措。尽管固态发酵技术存在着许多缺点，但是研究人员仍相信许多现存的固态发酵工业化生产的问题随着研究的深入终将会得到有效解决，从而为我国农林加工废弃资源的高效利用，开辟一条具有广阔前景的新途径。

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欢迎订阅2015年《植物资源与环境学报》

《植物资源与环境学报》(季刊)系江苏省·中国科学院植物研究所、江苏省植物学会等单位联合主办的学术刊物，国内外公开发行。本刊为全国中文核心期刊(北大)、中国科技核心期刊、中国科学引文数据库核心期刊(CSCD)和RCCSE中国核心学术期刊(A)，并为BA、CA、CAB、Elsevier′s、中国生物学文摘、中国环境科学文摘、中国科学引文数据库、万方数据--数字化期刊群、中国学术期刊(光盘版)和中文科技期刊数据库等国内外著名刊库收录。2013年荣获"江苏省首届新闻出版政府奖--期刊奖"；2014年荣获"江苏省精品科技期刊"称号。

该刊围绕植物资源与环境两个中心命题，报道我国植物资源的考察、开发利用和植物物种多样性保护，自然保护区与植物园的建设和管理，植物在保护和美化环境中的作用，环境对植物的影响以及与植物资源和植物环境有关学科领域的原始研究论文、研究简报和综述等。凡从事植物学、生态学、自然地理学以及农、林、园艺、医药、食品、轻化工和环境保护等领域的科研、教学、技术人员及决策者均可以从本刊获得相关学科领域的研究进展和信息。

该刊大16开本，120页。邮发代号：28-213 ，全国各地邮局均可订阅，每期定价20元，全年80元。若错过征订时间或需补齐1992年至2013年各期者，请直接与编辑部联系邮购。1992年至1993年每年8元；1994年至2000年每年16元；2001年至2005年每年24元；

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Research Progress of Livestock Protein Feedstuff Preparationby Solid State Fermentation

XIE Pu-jun1,2, HUANG Li-xin1,2, ZHANG Cai-hong1,2, YOU Feng1,2, ZHANG Yao-lei1,2

(1.Research Institute of Forestry New Technology,CAF, Beijing 100091, China; 2. Institute of Chemical Industry of ForestProducts,CAF;National Engineering Lab.for Biomass Chemical Utilization;Key and Open lab.on Forest ChemicalEngineering,SFA;Key Lab. of Biomass Energy and Material,Jiangsu Province, Nanjing 210042, China)

Research progress of solid state fermentation (SSF) to produce protein forage at home and abroad was reviewed.The advantages and disadvantages of SSF,and the influenting factors of SSF including kinds of substrate,strain selection,technical parameters were expounded in detail.Furthermore,the problem and key technology in the process of SSF were discussed to provide a reference for the further process of the farming and forestry residues.

solid state fermentation;technology parameters;protein feedstuffs;research progress

2014- 07- 23

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(CAFINT2013C04); 国家863计划资助(2011AA100802)

谢普军(1986—)，男，江西丰城人，博士生，主要从事天然产物化学及发酵技术研究。E-mail:xpjdzh@163.com

*通讯作者：黄立新(1967—)，男，江苏太仓人，研究员，博士，博士生导师，主要从事天然产物化学与发酵技术。E-mail:l_x_huang@163.com。

10.3969/j.issn.1673-5854.2014.05.008

TQ35

A

1673-5854(2014)05- 0039- 08