小黑杨eIF5A2/4基因的克隆及其增强酵母对非生物胁迫抵抗能力1)

曹凤娟 郑唐春 赵思雯 代丽娟 曲冠证

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

小黑杨eIF5A2/4基因的克隆及其增强酵母对非生物胁迫抵抗能力1)

曹凤娟 郑唐春 赵思雯 代丽娟 曲冠证

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

利用PCR技术从小黑杨(Populussimonii×Populusnigra)叶片cDNA中克隆到2个杨树真核翻译起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 5A)基因(eIF5A2/4)。利用双酶切法分别构建了含有eIF5A2/4的酵母表达载体pYES2-eIF5A2/4，转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)尿嘧啶营养缺陷型菌株INVSc1，挑取转化子进行PCR和Northern blot鉴定，证实获得了转基因菌株且经半乳糖诱导后表达。通过比较转基因菌株和空载菌株在CdCl2、CuSO4、ZnSO4、NaCl、NaHCO3、山梨醇、H2O2胁迫下的生长状况，结果显示：转基因菌株在以上非生物胁迫条件下的存活菌落数均高于非转基因菌株，推测杨树eIF5A2/4基因具有增强酵母菌对非生物胁迫抵抗力的功能。

小黑杨；eIF5A基因；酵母；非生物胁迫

Populussimonii×Populusnigra;eIF5A; Yeast; Abiotic stress

真核生物的翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A)(eIF5A，原名eIF-4D)，是一种高度保守的蛋白质。它在真核细胞内普遍存在，是迄今为止发现的唯一含有hypusine残基的蛋白质，这种独特的赖氨酸是翻译后通过Nε-(4-氨基)赖氨酸合成酶和Nε-(4-氨基)赖氨酸水解酶的作用下形成的。每一个成熟的eIF5A仅含1个hypusine残基，且eIF5A的hypusine修饰是其发挥功能、细胞存活和增殖所必须的[1-2]。eIF5A的功能主要是以蛋白质合成起始功能为基础，通过促进一些特异mRNA的转移及相关特异基因的表达来促进细胞的增殖或者细胞的衰老、死亡，或者产生环境胁迫的应答和抵抗能力[3]。

从目前的研究来看，大多数的真核生物的翻译起始因子5A(eIF5A)主要克隆自模式植物(如拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)[4])和其它甜土植物(如水稻(OryzasativaL.)[5]、玉米(ZeamaysL.)[6]、小麦(TriticumaestivumL.)[7]等)，而克隆自木本植物的eIF5A基因鲜有报道[8]。杨树(Populusspp.)是世界上分布最广、适应性较强的树种，同时也是非常重要的用材树种，具有无性繁殖容易、生长速度快、生产周期短等优点，发展杨树人工林是解决木材短缺的重要途径之一。同时杨树被作为木本转基因植物中的模式植物，是目前林木树种遗传转化研究中的典型代表种[9]。小黑杨(Populussimonii×Populusnigra)是中国林业科学院于1959年经小叶杨和黑杨杂交而来。多年实践证明小黑杨是速生丰产的好树种，在生长速度、抗寒、抗旱、抗病虫害等优良特性上均强于小叶杨和小青杨，特别在黑龙江省西部干旱、寒冷地区长势更好，10 a即可成为建筑材，可为我国北方沙荒、干旱地区优良速生绿化树种。目前对杨树eIF5A基因的功能验证未见报道，本文以小黑杨为实验材料，克隆出来2个eIF5A同源基因，初步在酵母中验证了杨树eIF5A基因在非生物胁迫下的应答反应，以期为进一步开展杨树eIF5A的基因功能和蛋白质的特性研究提供一定的操作基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

大肠杆菌DH5α感受态购自天根生化科技有限公司；酿酒酵母尿嘧啶营养缺陷型菌株INVSc1(His-,Leu-,Trp-,Ura-)及质粒pYES2购自Invitrogen公司；引物合成、测序由北京六合华大有限公司完成；PCR相关试剂、限制性内切酶、T4DNA连接酶、PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix EX Taq Ⅱ等购自TaKaRa公司(大连)；酵母质粒提取用酵母质粒提取试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；植物RNA快速提取试剂盒EasyPure Plant RNA Kit购自北京全式金公司；Northern blot检测相关试剂均购自Roche公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 小黑杨eIF5A基因克隆

用EasyPure Plant RNA Kit试剂盒提取小黑杨组培苗的总RNA，检测纯度和浓度后，以0.5 μg总RNA为起始材料，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒进行cDNA合成。以单链cDNA为模板，利用表1中的引物进行PCR扩增。反应程序如下：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共35个循环，72 ℃再延伸7 min，PCR结束后取3 μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。利用凝胶回收试剂盒回收目的片段，送华大公司测序。

1.2.2 小黑杨eIF5A基因在杨树中的组织表达特异性分析

在2012年9—10月份采取东北林业大学校园内小黑杨的成熟与衰老叶片，在2013年4—5月份采取小黑杨雄雌花序，用液氮冷冻处理并存放在-80 ℃，用于RNA的提取。

用EasyPure Plant RNA Kit试剂盒分别提取小黑杨组培苗的根、茎、叶、幼苗及多年生小黑杨的成熟叶、雌雄花序的总RNA，检测纯度和浓度后，以0.5 μg总RNA为起始材料，采用反转录试剂盒进行cDNA合成。将合成的第一链cDNA加去离子水稀释10倍，作为模板，进行实时荧光定量RT-PCR检验。反应体系为：10 μL 2×SYBR premix ExTaq、引物(见表1)Primer-F(10 μmol/L)和Primer-R(10 μmol/L)各1、2 μL稀释的各样品的模板，加去离子水补足20 μL。PCR反应在OPTIONⅡ荧光定量PCR仪上完成。反应条件为：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性12 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；80 ℃读板1 s，45次循环。用Actin基因作为内参(见表1)，用2-△△CT方法进行基因的相对定量分析[10]。

1.2.3 酵母表达载体的构建及酵母细胞的转化

根据表1中的引物扩增目的基因，同时提取含有酵母表达载体pYES2的质粒，用EcoR I、SacI内切酶对目的基因及pYES2质粒进行双酶切，分别回收目的片段后，利用T4DNA连接酶连接后从而得到pYES2-eIF5A2/4酵母表达载体。提取质粒送北京华大公司测序，验证是否将目的基因插入到酵母表达载体pYES2中。

1.2.4 酵母表达载体转化酿酒酵母菌株INVSc1及Northern blot鉴定

按照Invitrogen公司的操作说明，将质粒pYES2和pYES2-eIF5A2/4转入酿酒酵母中，分别标记为INVSc1(pYES2)和INVSc1(pYES2-eIF5A2/4)。

在无菌条件下分别挑取INVSc1(pYES2)和INVSc1(pYES2-eIF5A2/4)单菌落接种于SC-Ura培养基中，200 r/min，30 ℃振荡培养20 h。测定培养物OD600值，取一定量的培养物，4 000 r/min，离心1 min，弃上清，菌体重悬于一定量的诱导培养基(SC-Ura+2%半乳糖)中使菌液OD600=0.4，30 ℃诱导表达36 h。参照Schmitt等[11]的方法提取酵母细胞总RNA。取10 μg总RNA，经甲醛胶变性电泳并转移到N+尼龙膜上，最后用紫外交联仪处理(254 nm,8 min)。按照Roche公司的DIG Nucleic Acid Detection Kit使用说明，以含有DIG标记的dUTP为原料，利用PCR方法克隆eIF5A2/4基因作为探针，利用Northern blot方法检测eIF5A2/4基因在酵母中的表达。

1.2.5 非生物胁迫处理

挑取重组酵母INVSc1(pYES2-eIF5A2/4)和对照酵母INVSc1(pYES2)单菌落，接种于SC-Ura液体培养基(以2%葡萄糖为碳源)中，30 ℃振荡培养20 h左右。

测定培养物OD600值，取一定量的培养物，4 000 r/min，离心1 min，弃上清，菌体重悬于10 mL诱导培养基(SC-Ura+2%半乳糖)中菌体OD600=0.4，30 ℃诱导表达36 h。

再测定培养物OD600值，取一定量的培养物，4 000 r/min，离心1 min，弃上清。菌体分别重悬于200 μL H2O、3 mmol/L CdCl2、0.2 mol/L CuSO4、0.2 mol/L ZnSO4、5% NaCl、0.5 mol/L NaHCO3、2 mol/L山梨醇、0.01% H2O2中，使得菌液OD600=2.0。上述5% NaCl和2 mol/L山梨醇处理24 h，其他胁迫分别处理2 h。

将菌液依次稀释10、100、1 000、10 000、100 000倍后取3 μL接种于SC-Ura(2%葡萄糖为碳源)固体培养基，30 ℃倒置培养2 d左右，观察菌落存活情况。

表1 PCR引物的名称及序列

2 结果与分析

2.1 小黑杨eIF5A2/4基因的克隆

从小黑杨的叶片cDNA中克隆到2条eIF5A基因序列(图1)，暂时命名为eIF5A2(GenBank No.KC521463)和eIF5A4(GenBank No.KC521464)。通过对核酸序列分析发现，这2条同源基因的开放阅读框(ORF)均为483 bp，共预测编码160个氨基酸。通过ExPASY网站(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)在线分析，预测2条同源基因编码蛋白的分子量大约为17.5 kDa，等电点pI为5.60。

M.DNA marker DL5000；泳带1.eIF5A2基因；泳带3.eIF5A4基因；泳带2,4.阴性对照。

图1 小黑杨eIF5A2/4基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳

2.2 小黑杨eIF5A2/4基因的组织表达特异性

为了研究小黑杨eIF5A2/4的生物学功能，本试验对杨树不同的组织提取RNA，利用实时定量PCR技术检测eIF5A2、eIF5A4基因在不同的组织中表达差异。结果显示，小黑杨eIF5A2基因在根和茎中的表达水平相对较低，而在雄花、雌花、茎尖、幼叶和老叶等组织中具有中等表达水平，而在成熟叶片中的表达水平最高(是根中含量的30倍)；小黑杨eIF5A4基因在不同组织的表达水平与eIF5A2基因比较类似，也是在根中的具有低水平表达，在成熟叶中具有高水平表达(表2)。

表2 小黑杨eIF5A2/4基因在的不同组织中相对表达水平

2.3 酵母表达载体的构建及验证

用EcoR I、SacI内切酶对pYES2质粒和基因片段进行双酶切，分别回收目的片段后，利用T4DNA连接酶连接后从而得到pYES2-eIF5A2/4重组子，分别挑取8个单克隆进行菌液PCR检测，获得600 bp左右目的条带(483 bp的外源基因片段+100 bp左右的载体片段)(图2)。抽提质粒送公司测序结果显示，小黑杨eIF5A2/4基因分别整合到酵母表达载体pYES2中，未发生碱基突变，至此酵母诱饵表达载体构建完成。

2.4 转eIF5A2/4基因酵母的Northern blot检测

根据TE/LiAc法制备INVSc1酵母感受态，采用PEG/LiAc法将酵母表达载体转化到酵母感受态中，涂布SC/-Ura平板上筛选阳性克隆。对获得的重组酵母经初步检测后，采用诱导培养基(SC-Ura+2%半乳糖)诱导外源基因表达。分别提取重组酵母INVSc1(pYES2-eIF5A2/4)抑制培养36 h和诱导培养36 h的总RNA，同时提取对照酵母INVSc1(pYES2)抑制和诱导培养36 h的总RNA。Northern blot结果显示(图3)：对照酵母INVSc1(pYES2)经抑制和诱导培养后均检测不到杂交信号，而重组酵母INVSc1(pYES2-eIF5A2)和INVSc1(pYES2-eIF5A4)在抑制培养中检测不到信号，将碳源更换为半乳糖诱导培养基后，检测到目的条带，说明重组酵母经诱导后正常表达。

2.5 转基因酵母的非生物胁迫

为全面了解小黑杨eIF5A基因与胁迫的关系，本实验将转基因酵母经2%半乳糖诱导表达30 h后，经过各种胁迫物质处理后，按10倍逐级稀释5级，然后将菌液点在SC-Ura培养基(2%葡萄糖为碳源)上，于30 ℃培养3 d后拍照观察。如图4所示：H2O处理的对照显示转eIF5A基因酵母与转空载酵母生长状态基本一致，无明显差异；经0.2 mol/L ZnSO4、5% NaCl、0.5 mol/L NaHCO3、2 mol/L山梨醇和0.01% H2O2胁迫后，转基因酵母与转空载酵母在稀释105倍后，菌落数量虽均明显少于H2O对照处理，但转基因酵母存活的菌落多于转空载酵母；经3 mmol/L CdCl2胁迫后，转基因酵母生长数量明显高于转空载酵母，菌落数约高出1个数量级；经0.2 mol/L CuSO4胁迫后，酵母生长状态差异极其显著，存活菌落数约高出3个数量级。

M.DNA marker DL5000；泳带1-8.8个pYES2-eIF5A2重组子的菌液PCR产物；泳带10-17.8个pYES2-eIF5A4重组子的菌液PCR产物；泳带9和18.阴性对照。

图2 酵母表达载体pYES2-eIF5A2/4菌液PCR产物电泳

1.对照酵母INVSc1(pYES2)抑制36 h；2.对照酵母INVSc1(pYES2)诱导36 h；3.重组酵母INVSc1(pYES2-eIF5A2)抑制36 h；4-5.2个重组酵母INVSc1(pYES2-eIF5A2)株系诱导36 h；6.重组酵母INVSc1(pYES2-eIF5A4)抑制36 h；7-8.2个重组酵母INVSc1(pYES2-eIF5A4)株系诱导36 h。

图3 转基因酵母的Northern blot检测

3 结论与讨论

eIF5A基因自发现起一直广受研究者的关注，研究表明植物eIF5A基因在植物生长发育中发挥着的重要作用[12-13]。在植物中，已有文献表明eIF5A基因具有多种异构体，诸如拟南芥有3种(AAG53646、AAG60110、AAM61392)、小麦有3种(DQ167202、DQ167201、DQ167203)、番茄有4种(AF296083、AF296084、AF296085、AF296086)。各种异构体分别承担不同的生物学功能，共同完成调控生物生长发育、衰老及环境适应等的生物学功能。Thompson等[14]在拟南芥中的研究表明：eIF5A1只在衰老组织中表达，eIF5A2在受机械损伤的组织中高水平表达，而eIF5A3在细胞分裂很活跃的吸胀的种子中高水平表达。烟草中的两个的eIF5A基因NeIF5A1和NeIF5A2的表达存在差异。NeIF5A1更倾向于在光合作用的组织中表达，而NeIF5A2则是在所有检测的植物组织中组成型表达[15]。本实验克隆出2条小黑杨eIF5A基因，通过NCBI数据库Blast分析表明，这2条基因分别和毛果杨eIF5A2和eIF5A4基因氨基酸序列完全一致，且这2条基因也只有3个氨基酸上的差异，推测这2条基因在杨树中高度保守，且在功能上存在互补作用。

周建平等[7，16]对小麦eIF5A基因的研究表明，小麦eIF5A在根、成熟期的旗叶中低水平表达，而在幼叶、花粉、幼穗、幼胚等长势旺盛的部位(组织)中表达水平较高，这说明小麦eIF5A基因具有组织表达的差异性。本研究通过对杨树不同组织的eIF5A基因表达水平检测，发现与上述小麦eIF5A基因的表达相似，只是在杨树的幼苗中表达水平并不高，这可能和选取的材料是组培环境下的材料有关。先前已有研究报道水稻eIF5A基因受盐胁迫诱导高表达[17]，柽柳eIF5A基因在转基因酵母中盐及渗透胁迫具有抗性[18]。初步说明，eIF5A基因与非生物胁迫有关，而本研究中杨树eIF5A基因转酵母对盐和渗透胁迫并未表现出显著差异，而是在Cu2+、Cd2+、Zn2+等重金属离子胁迫下有更高的表达。这说明eIF5A虽是高度保守性蛋白，但其功能仍存在物种间差异，说明该基因在植物体内可能参与多种非生物胁迫响应途径。

我国重金属污染土壤的面积在逐渐扩大，程度不断加深，急需成熟、高效的植物修复技术的应用。目前研究人员已经开始利用植物基因工程技术分离克隆出多种相关基因，如金属硫蛋白、植物螯合肽、液泡转运蛋白等金属结合蛋白基因，以提高植物的超积累能力或在植物体内建立一条更广泛的重金属代谢途径。本研究通过研究杨树eIF5A基因的表达模式，并首次将其转到真核模式生物酿酒酵母中分析其功能，发现该基因的表达能提高宿主酵母菌株对Cu2+等重金属离子胁迫的抗性，这具有重要的应用价值，同时也为后期在转基因林木等植物方面的研究奠定理论基础。

EV.转空载体pYES2的酵母菌落；eIF5A2.转重组载体pYES2-eIF5A2的酵母菌落；eIF5A4.转重组载体pYES2-eIF5A4的酵母菌落。

[1] Caraglia M, Marra M, Giuberti G, et al. The role of eukaryotic initiation factor 5A in the control of cell proliferation and apoptosis[J]. Amino Acids,2001,20(2):91-104.

[2] Gordon E D, Mora R, Meredith S C, et al. Eukaryotic initiation factor 4D, the hypusine containing protein, is conserved among eukaryotes[J]. Biol Chem,1987,262(34):16585-16589.

[3] 双宝,韩英鹏,李明,等.真核细胞翻译起始因子5A(eIF5A)研究进展[J].东北农业大学学报,2010,41(8):156-160.

[4] Wang T W, Lu L, Zhang C G, et al. Pleiotropic effects of suppressing deoxyhypusine synthase expression inArabidopsisthaliana[J]. Plant Mol Biol,2003,52(6):1223-1235.

[5] Chou W C, Huang Y W, Tsay W S, et al. Expression of genes encoding the rice translation initiation factor, eIF5A, is involved in developmental and environmental responses[J]. Physiol Plant,2004,121(1):50-57.

[6] Dresselhaus T, Cordts S, Lörz H. A transcript encoding translation initiation factor eIF-5A is stored in unfertilized egg cells of maize[J]. Plant Mol Biol,1999,39(5):1063-1071.

[7] 周建平,杨足君,冯娟,等.小麦蛋白翻译起始因子5A基因(eIF5A)的克隆与分析[J].遗传,2006,28(5):571-577.

[8] Hopkins M T, Lampi Y, Wang T W, et al. Eukaryotic translation initiation factor 5A is involved in pathogen-induced cell death and development of disease symptoms in Arabidopsis[J]. Plant Physiol,2008,148(1):479-489.

[9] 张红梅,夏新莉,尹伟伦.毛果杨的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯,2009,45(1):53.

[10] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod[J]. Methods,2001,25(4):402-408.

[11] Schmitt M E, Brown T A, Trumpower B L. A rapid and simple method for preparation of RNA from Saccharomyces cerevisiae[J]. Nucleic Acids Res,1990,18(10):3091-3092.

[12] Ma F, Liu Z, Wang T W, et al. Arabidopsis eIF5A3 influences growth and the response to osmotic and nutrient stress[J]. Plant Cell Environ,2010,33(10):1682-1696.

[13] Latha R, Salekdeh G H, Bennett J, et al. Molecular analysis of a stress-induced cDNA encoding the translation initiation factor, eIF1, from the salt-tolerant wild relative of rice[J]. Funct Plant Biol,2004,31(10):1035-1041.

[14] Thompson J E, Hopkins M T, Taylor C, et al. Regulation of senescence by eukaryotic translation initiation factor 5A: implications for plant growth and development[J]. Trends Plant Sci,2004,9(4):174-179.

[15] Chamot D, Kuhlemeier C. Differential expression of genes encoding the hypusine-containing translation initiation factor, eIF-5A, in tobacco[J]. Nucl Acids Res,1992,20(4):665-669.

[16] 周建平,杨足君,白丽莉,等.小麦蛋白翻译起始因子5A(eIF5A)表达载体构建及原核表达[J].应用与环境生物学报,2007,13(3):301-303.

[17] Mehta A M, Saftner R A, Mehta R A, et al. Identification of posttranslationally modified 18-kilodalton protein from rice as eukaryotic translation initiation factor 5A[J]. Plant Physiol,1994,106(4):1413-1419.

[18] Wang L, Xu C, Wang C, et al. Characterization of a eukaryotic translation initiation factor 5A homolog fromTamarixandrossowiiinvolved in plant abiotic stress tolerance[J]. BMC Plant Biol,2012，12(1):118-134.

1) “十二五”农村领域国家科技计划课题(2013AA102704-0103)资助。

曹凤娟，女，1989年9月生，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，硕士研究生。

曲冠证，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，副教授。E-mail:quguanzheng@hotmail.com。

2013年7月8日。

Q786; Q939.5

Enhancement of Tolerance to Abiotic Stress ofSaccharomycescerevisiaeTransformed by Genes Encoding Translation Initiation Factor,eIF5A2/4, fromPopulussimonii×Populusnigra/Cao Fengjuan, Zheng Tangchun, Zhao Siwen, Dai Lijuan, Qu Guanzheng(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(4).-16～20

责任编辑：潘 华。

Two genes encoding translation initiation factor,eIF5A2/4, were amplified by PCR from thePopulussimonii×Populusnigraleaf cDNA library. To confirm the tolerance ofeIF5A2/4 to abiotic stresses, a yeast expression vector pYES2-eIF5A2/4 was constructed and transformed intoSaccharomycescerevisiaestrain INVSc1 with uracil auxotrophic phenotype. Northern blot method was used to detect theeIF5A2/4 mRNA transcription in yeast induced by galactose. The yeast expression strains ofeIF5A2/4 were constructed successfully. By comparing the colony numbers of transgenic INVSc1 (pYES2-eIF5A2/4) with non-transgenic INVSc1 (pYES2) grown in medium containing CdCl2, CuSO4, ZnSO4, NaCl, NaHCO3, sorbitol and H2O2stress, the survival colony numbers of transgenic INVSc1(pYES2-eIF5A2/4) are more than that of non-transgenic INVSc1 (pYES2), respectively. The results confirm thateIF5A2/4 can enhance the tolerance of yeast to abiotic stresses.eIF5A2/4 may play important roles in resistance of tree to abiotic stresses.