一种白头鹤血细胞计数方法的建立及应用1)

何相宝 侯志军 何少文 王 纳 李 杰 金 辛

(哈尔滨北方森林动物园，哈尔滨，150300) (东北林业大学) (陕西佛坪国家级自然保护区) (东北林业大学)

一种白头鹤血细胞计数方法的建立及应用1)

何相宝 侯志军 何少文 王 纳 李 杰 金 辛

(哈尔滨北方森林动物园，哈尔滨，150300) (东北林业大学) (陕西佛坪国家级自然保护区) (东北林业大学)

为了确定白头鹤红细胞数、白细胞数及白细胞分类计数的生理值，以便给患病的白头鹤提供必要的血液学诊断依据，采用了传统的直接稀释法对白头鹤红细胞进行了计数，应用新建立的白细胞分离法对白头鹤的白细胞进行了计数。经测定，白头鹤红细胞的数量为0.415×1012/L，白细胞的数量为2.84×109/L，中性粒细胞为0.986×109/L，嗜碱粒细胞为0.345×109/L，嗜酸性粒细胞为0.277×109/L，淋巴细胞为1.233×109/L。

白头鹤；血细胞计数；白细胞分离法

白头鹤是世界现存15种鹤类之一，是国家I级重点保护野生动物,被国际自然保护联盟(ICUN)列为易危物种，并列入CETES附录I中[1-3]。

家禽的血细胞计数方法已经得到了广泛的应用[4-5]，但是家禽血细胞计数方法是否适用于白头鹤还不清楚，白头鹤血细胞计数的生理参考值也未建立。各种动物的红细胞手工计数方法均可采用稀释法，哺乳动物白细胞计数主要采用稀酸破坏法，家禽白细胞技术主要采用直接染色法[6]。对白头鹤白细胞计数，本研究先采用了传统的稀酸破坏红细胞法、直接染色法，但计数效果均不理想。新建立的白细胞分离法则功的完成了对白头鹤白细胞的计数。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

血细胞计数板；一次性真空采血管(肝素抗凝)；23 K超速低温离心机(HERMLE)；LD5-2A型低速离心机；1640缓冲液；淋巴细胞分离液；肝素；胎盘蓝。

1.2 样本

2012年6月在哈尔滨北方森林动物园用真空采血管采集了2只白头鹤抗凝血样本，放入冰箱内4 ℃保存，备用。

1.3 方法

1.3.1 红细胞计数

加生理盐水995 μL于EP管中，用移液器吸取抗凝血5 μL，擦去管外余血，轻轻加至装有生理盐水的EP底部，再轻吸上清液清洗枪头3次，上下颠倒混匀。混匀后用移液枪将红细胞悬液转入到血细胞计数板的计数池中，室温下平放3 min，待细胞下沉后于显微镜下计数。

1.3.2 白细胞计数方法的建立

由于对白头鹤白细胞计数的方法还不是很成熟，所以先用鸡血进行了预实验。具体试验方法如下：

取5 mL鸡抗凝血放在10 mL离心管内，向其中加入等量的1 640缓冲液混匀。取50 mL的离心管，将10 mL的人淋巴细胞分离液注入试管底部，然后将血液和1 640混合液缓慢的注入，使血液和1 640混合液漂浮在人淋巴细胞分离液的上面。将含有混合液的50 mL离心管放入离心机，3 000 r/min离心15 min。离心后，红细胞、白细胞、血清分为3层，上层为血清，中间为白细胞，最底部为红细胞。将血清和白细胞全部吸入到另外一个50 mL的离心管中，放入离心机中，3 000 r/min,离心10 min。离心后，弃掉所有液体，保留沉淀，向其中加入10 mL淋巴细胞分离液充分混合均匀。然后吸出100 μL白细胞浑浊液放入1.5 mL EP管中，加入900 μL的1 640缓冲液混合均匀。吸取200 μL的白细胞和1 640混合液放入到另外一个EP管内，向其中加入等量的台盼蓝，染色2 min。将染色的白细胞悬液冲入血细胞计数板的计数池，室温下平放3分钟，待细胞下后于显微镜下计数。

用此方法，对同一样本进行3次重复实验。

1.3.3 白细胞计数

用建立的白细胞分离计数法测定白头鹤的白细胞数，具体方法同1.3.2。

1.3.4 白细胞分类计数

涂片染色计数法[6]。

2 结果与分析

2.1 预实验

对同一只鸡进行3次重复实验，测得其白细胞数分别为26×109、23×109、27×109个·L-1，经计算，其平均值为(25.33±2.08)×109个·L-1，相对标准偏差为8.217%。本实验先用家鸡进行了预实验，建立了一种禽类白细胞的测定方法。在预实验中，同一样本3次重复实验的相对标准偏差为8.217%，说明新建立的实验方法重复性很好。预实验获得的鸡白细胞数量为25.33×109个·L-1，和以往文献记载的鸡的白细胞数量基本相当[4-6]，进一步验证了本实验方法的有效性。

用淋巴细胞分离液将红细胞和白细胞分离开的方法已经广泛地应用到禽类白细胞的相关研究中[7]，徐先云用此方法分离了野鸟的白细胞，并对白介素-2进行了研究[8]。本实验借用此技术，分离了鸡的白细胞，在对其染色后进行了计数，新建了一种禽类白细胞计数的方法。

2.2 白头鹤细胞计数

按照1.3中描述的实验方法，测得2只白头鹤的平均红细胞数是(0.415±0.134)×1012个·L-1，白细胞数是(2.84±0.58)×109个·L-1，中性粒细胞0.986×109个·L-1，嗜碱粒细胞0.345×109个·L-1，嗜酸性粒细胞0.277×109个·L-1，淋巴细胞1.233×109个·L-1。

本实验测出的白鹤红细胞和白细胞的数量(0.415×1012、2.84×109个·L-1)，和其他鹤类相比数量偏低(见表1)，需要在以后的研究中进一步积累数据进行分析其原因。

在用分离法分离白头鹤白细胞的过程中，由于离心之后红细胞层和白细胞层相临，在操作的过程要避免白细胞收集的不完全或者带有少量的红细胞的现象出现，以免影响实验的准确性。将分离获得的白细胞用台盼蓝染色，可使白细胞在显微镜下的形态更加清晰，方便白细胞的计数，减少实验误差。

表1 鹤类血细胞计数参考值 个·L-1

在对白细胞计数时，由于禽类的红细胞不容易破裂，所以禽类白细胞计数不用稀酸破坏红细胞法，而采用直接染色法。但在本次实验中，一直不能将白头鹤的白细胞染色，使得无法用直接染色法对白头鹤进行白细胞计数。家鸡白细胞计数可以用直接染色法而白头鹤不行的原因尚不清楚，需要进一步分析。

3 结束语

本次试验获得了白头鹤的血常规生理指标，为白头鹤在患病时做血常规诊断提供了依据，但实验样本量偏少，需在以后进一步收集实验样本进行测定分析，以减少实验误差。

[1] Luo Jinming, Wang Yongjie, Yang Fan, et al. Effects of human disturbance on the Hooded Crane (Grusmonacha) at stopover sites in northeastern China[J]. Chinese Birds,2012,3(3):206-216.

[2] Zang Lili, Zhou Lizhi , Dai Yanli. Genetic structure of wintering Hooded Cranes (Grusmonacha) based on mitochondrial DNA D-loop sequences[J]. Chinese Birds,2012,3(2):71-81.

[3] 郭玉民.小兴安岭白头鹤(Grusmonacha)繁殖行为生态学研究[D].哈尔滨，东北林业大学，2005.

[4] 顾有方,徐强,李文超，等.GC02鸡球虫病疫苗免疫对鸡红白细胞数的影响[J].安徽科技学院学报,2008,22(1):9-12.

[5] 王闯.兴义矮脚鸡血液主要生理指标的研究[J].贵州农业科学,2009,37(11):132-134.

[6] 邓干臻.兽医临床诊断学[M].北京：科学出版社，2012.

[7] 谢昆，蒋成砚，全舒舟，等.鸡外周血淋巴细胞的分离和体外培养[J].中国家禽，2011，33(11)：57-58.

[8] 徐先云.野生雁鸭IL-2基因克隆、表达及其生物活性检测[D].哈尔滨，东北林业大学，2013.

[9] 张伟木.草海黑颈鹤和灰鹤的生理指标测[J].动物学杂志,1993,28(4)：39-41.

[10] 张才骏，廖炎发，许树仁.黑颈鹤几项生理指标测定[J].野生动物,1982(1):52-53.

[11] 夏咸柱，高宏伟，华育平.野生动物疫病学[M].北京：高等教育出版社，2011:1244-1251.

Count Method for Hooded Crane Blood Cells/

He Xiangbao

(Harbin North Forestry Zoo, Harbin 150300, P. R. China); Hou Zhijun(Northeast Forestry University); He Shaowen, Wang Na, Li Jie(Shannxi Foping National Nature Reserve); Jin Xin(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(6).-157～158

The experiment was conducted to get the data of hooded crane red blood cell count, white blood cell count, and white blood differential count in the health ones and provide the standard when hooded crane is in sick doing the blood diagnosis. The hooded crane red cells count was done by the dilution method, and the white cells count was done by new separation method. The red blood count of the hooded crane is 0.415×1012/L, the white blood count is 2.84×109/L, and the Neutrophil granulocyte, Basophil, Eosinophil, and Lymphocyte are 0.986×109/L, 0.345×109/L, 0.277×109/L, and 1.233×109/L.

Hooded crane; Blood cell count; White cell separation method

1) 中央高校基本科研业务费(DL13EA01)；黑龙江省博士后基金项目(LBH-Z12008)；中国博士后科学基金(2012M510908)国家林业局保护司项目。

何相宝，男，1975年6月生，哈尔滨北方森林动物园，工程师。

金辛，东北林业大学野生动物资源学院，博士研究生。E-mail：jinxin1103@163.com。

2013年8月20日。

S85.34+7.4

责任编辑：戴芳天。