四氮杂杯[2]芳烃[2]三嗪键合硅胶固相萃取串联高效液相色谱法测定水果中7种植物生长调节剂

张子方 陈彦龙 张文芬 王 菲 杜慧芳 导师：张书胜

（郑州大学化学系，河南 郑州 450001）

四氮杂杯[2]芳烃[2]三嗪键合硅胶固相萃取串联高效液相色谱法测定水果中7种植物生长调节剂

张子方 陈彦龙 张文芬 王 菲 杜慧芳 导师：张书胜

（郑州大学化学系，河南 郑州 450001）

本文建立了四氮杂杯[2]芳烃[2]三嗪键合硅胶（NCS）固相萃取串联高效液相色谱法（SPE-HPLC）测定水果中噻苯隆、2-（1-萘基）乙酸（α-萘乙酸）、对氯苯氧乙酸（防落素）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3）、1-（2-氯-4-吡啶基）-3’-苯基脲（KT-30）七种植物生长调节剂残留的新方法。实验采用自制四氮杂杯[2]芳烃[2]三嗪（NCS）作为固相萃取吸附剂提取、净化样品溶液，采用优化的W atersXBridge C18色谱分离柱和甲醇：0．1%磷酸溶液（55：45，v/v）流动相，在检测波长210 nm时，在0．3-200μg/m L浓度范围内七种植物生长调节剂线性相关性较好（R 2＞0．999）。七种植物生长调节剂回收率在77．2%-98．1%之间，相对标准偏差（RSD）小于5%，检出限在4-22 ng/m L之间。结果表明该方法具有操作简便、快速、灵敏、准确、重复性好等优点，可以满足植物生长调节剂残留的快速筛查和定量分析，是一种较为理想的多种植物生长调节剂同时分离检测的新方法。

四氮杂杯[2]芳烃[2]三嗪；固相萃取；高效液相色谱；植物生长调节剂

1 引言

植物生长调节剂对植物生长具有促进其根、发芽、发育、早熟、防止落花、落果、形成无子果实，或抑制其发芽、整枝脱叶等作用[1]，能显著地提高种植效益，因此，被广泛地应用于现代化的农业生产中。

然而与其他农药一样，植物生长调节剂也具有一定的毒性，如丁酰肼的水解产物二甲基联氨就是一种潜在的致癌物[2]。长期食用有植物生长调节剂残留的水果、蔬菜等，会对人体产生副作用，使人体分泌紊乱，影响代谢的平衡[3]。目前，植物生长调节剂的滥用、使用不当等导致的食品安全问题逐渐增多，由此引发的食品安全事故也频繁发生[4.6]，植物生长调节剂在食品中的残留也因此成为影响我国食品安全的主要因素之一。因此，建立食品中植物生长调节剂残留量的快速有效地检测方法，对保证食品安全，促进人类健康及社会经济发展都具有重大的现实意义。

目前，对植物生长调节剂的检测方法有很多种，其中包括气相色谱，液相色谱，气质联用，液质联用技术等[7-13]。但在这些检测中，气相色谱和气质联用在应用中往往需要衍生化处理，以降低待测物质的气化温度，相对复杂；毛细管电泳技术灵敏度高，检测限低但重现性差，不利于定量分析检测；液相色谱、液相色谱-质谱联用是近年来发展应用最为广泛地检测方法，但液相色谱-质谱联用技术仪器成本较高，不利于一般实验室的普及，且基质效应影响严重，对前处理要求苛刻；然而液相色谱相对简单，可操作性强，且成本低易于普及，仅需简单的前处理过程，可以满足分析需求。

植物生长调节剂的检测多伴随复杂基质的存在都需要经复杂的前处理过程，目前，前处理方法主要包括加速溶剂萃取（ASE），液液萃取（LLE）和固相萃取。其中ASE和LLE是较为传统的处理方式，处理过程中容易造成靶标物的损失，且需要消耗大量的有毒害的有机溶剂和劳动力，因此，近年来新型的固相萃取技术成为目前常用的前处理手段。常用的萃取柱有C18柱、HLB柱等，成本较高且作用力模式单一，不利于多种植物生长调节剂的同时净化与富集。因此，有必要发展一种新型的固相萃取材料，实现多种植物生长调节剂的同时富集检测。

我们课题组前期的大量研究工作表明四氮杂杯[2]芳烃[2]三嗪固相萃取吸附剂（图1，颗粒直径为40-60um）具有多重作用力模式[14-17]，适用于复杂基质中痕量靶标物质的富集与净化，本文采用这种自制的杯芳烃固相萃取小柱，旨在建立多种植物生长调节剂简单、快速、廉价、环保的同时分离检测新方法。

图1 NCS结构式

2 实验部分

2.1 仪器，材料和试剂

葡萄、西瓜、苹果、桃子（均购置于当地超市），2-（1—萘基）乙酸（萘乙酸，含量按98%计）、对氯苯氧乙酸（防落素，含量按98%计）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D，含量按98%计）、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA，含量按98%计）、赤霉素（GA3，含量按98%计）、1-（2-氯-4-吡啶基）-3’-苯基脲（KT-30，含量98%计）；超纯水（电阻率≥18.2MΩ·cm）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国J&TBaker公司）；磷酸（天津市科密欧科技有限公司）。Agilent1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；CP2245电子分析天平（感量：0.0001 g，德国Sartorius公司）；Milli—Q超纯水仪（美国Millipore公司）；Turbo Vap II氮吹浓缩仪（美国Zymark公司）；Sigma 3-15低温高速离心机（德国Sigma离心机公司）；KQ一700DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2.2 方法

2.2.1 NCS固相萃取柱的制备。自制NCS固相萃取小柱：商品化的聚丙烯空柱管（规格为100mg/3cc，迪马科技公司）先用水和甲醇清洗，柱管的出口端与真空泵连接并使柱管垂直，称取100mg自制的NCS，在负压作用下装入柱管，柱管中填料的两底端分别用聚丙烯筛板固定，适度振实，备用。

2.2.2 样品处理与分析

称取样品2.0 g（精确到0.001 g）匀浆后置于50mL具螺旋盖聚丙烯离心管中，加入10mL甲醇溶液，漩涡振荡1min，在4℃下静置过夜后超声提取10min，2000 r/min转速离心10min，取上层清液于30℃旋干浓缩，用水定容至1mL，后上样至依次经4 mL乙腈活化，4mL水平衡后的NCS（或C18）柱床，采用3mL/min的流速过固相萃取小柱。后用4mL水淋洗柱床，6mL乙腈洗脱，收集洗脱液至15mL具刻度的试管中，45℃氮吹浓缩至近干，用甲醇定容至1.0mL。溶液过0.22mm滤膜，滤液供HPLC分析。

2.3 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge C18（250×4.6mmi.d.，5μm），流动相：甲醇：0.1%磷酸水溶液（55：45，v/v），流速：0.7mL/min，进样量：20μL，VWD紫外检测波长：210 nm。

2.4 标准溶液的配制

萘乙酸、2，4-D、噻苯隆、6-BA、GA3、防脱落素、KT-30标准品0.02 g溶于100ml容量瓶中，逐级稀释成2倍、5倍、25倍、125倍、625倍并绘制标准曲线。

3 结果与讨论

3.1 固相萃取条件优化

本实验使用四氮杂杯［2］芳烃［2］三嗪键合硅胶吸附剂（NCS）对七种进行富集，并且对NCS用量、吸附容量、不同洗脱剂、洗脱剂的用量、上样体积、样品pH值、上样流速等影响固相萃取效率的因素进行了优化，最终选定条件为：100mg/3cc的固相萃取小柱，6mL的乙腈为洗脱剂，上样流速3mL/min，上样pH不需调整，富集效果如图2所示。

图2 NCS与C18固相萃取效果对比

3.2 标准曲线与检测限

将1.4中的一级内标储备溶液逐级稀释2倍、5倍、25倍、125倍、625倍并绘制标准曲线，将配制的标准工作溶液由低到高浓度进行HPLC，以各标准物质的峰面积（Y）对相应的浓度（X，ng/ mL）进行线性回归分析，得到七种植物生长调节剂的工作曲线回归方程和相关系数r。将各物质最低浓度的标准工作溶液重复进样5次，计算标准偏差，以3倍标准偏差为方法的检出限，10倍标准偏差为定量限，结果如表1所示，在0.3-200μg/mL的线性动态范围内混合物组分的线性相关系数较好，表明该方法线性关系良好。

表1 七种植物生长调节剂的线性方程、检出限和定量限

3.3 回收率和精密度实验

取空白桃子，制备低、中、高3种浓度（0.1、1和10μg/mL）的加标样品，按前述样品前处理方法处理样品。低、中、高3个浓度的质控样品分别取6份做日内精密度分析，得回收率和日内相对标准偏差。结果（表2）表明，低、中、高3个水平样品的回收率在77.2%～98.1%之间，精密度在0.95%～4.53%之间，说明本方法的重复性较好、准确度较高。

表2 桃子中植物生长激素的加标回收率

3.4 实际样品测定，采用上述方法，我们对市售的火龙果和葡萄进行了检测，结果如表3所示。从以下结果可以看出，该方法可以成功的应用于水果实际样品农残的检测。

表3

4 结论

四氮杂杯[2]芳烃[2]三嗪键合硅胶作为一种新型杂杯芳烃固相萃取材料，其对水果中七种植物生长激素的萃取效果要优于商品化的C18固相萃取柱。所建立的NCS固相萃取／HPLC方法操作简便、准确度高，适合于不同水果中多种植物生长调节剂的检测。

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1671-0037（2014）11-106-3

张子方（1982.12-），男，本科，工程师，在读在职研究生，研究方向：分析化学（仪器分析）。