液体磁流芯片检测牛白血病方法的建立

赵卫东，刘伟，王玉玲，刘国红，郑文杰

（天津出入境检验检疫局动植物和食品检测中心，天津300461）

牛白血病（EBL）最初于1878年在德国被发现，现已呈全球性分布，且发病范围不断扩大，在某些牛群中血清阳性率高达60%[1]，中国的安徽、重庆、新疆、江西等地都有发病的报道，且感染率较高（10%～50%）。该病病程长，一般在症状出现数周或数月后死亡。在欧洲有该病流行的牛群，每年由于本病所导致的死亡率约为2%，也有的高达5%。该病被认为有明显的家系倾向和免疫抑制性，现已经成为影响养牛业的重要传染病之一[2-4]。带有传染病的奶牛不但会引起家畜传染病的爆发，还会影响牛奶和奶制品的品质。该病是人畜共患病，可经牛奶途径传染给人类，引起消费者尤其是免疫力低下的弱势人群发病。

目前国外对牛白血病的检测主要是采用ELISA方法，已成功研制出基于gp51、p24抗体的检测试剂盒[5-6]。国内对牛白血病病毒检测方法较少，有过应用PCR和PCR-ELISA方法进行检测的报道[7-8]，但由于技术原因，未有成熟的诊断产品出现，主要使用国外进口的ELISA试剂盒对EBL实施检疫和市场普查。而对国外检测试剂盒的过分依赖，使我国进口牛检疫和普查工作处于成本高且容易受制的被动状态。一旦病毒传入，不仅将直接损害奶牛养殖户的切身利益，妨碍我国“三农”工作的顺利进行，而且还将威胁我国人民的健康和生命安全。

本研究自主研发了液体磁流芯片方法，可取代国外试剂盒检测方法，用于对我国进口牛和养殖牛EBL的检疫和普查。

1 材料与方法

1.1 试剂材料与仪器

gp51肽偶联免疫磁珠：由天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心实验室制备并保存于4℃冰箱内备用；5%猪血清：猪血清用PBST稀释到需要浓度；5%羊血清：羊血清用PBST稀释到需要浓度；5%脱脂乳：准确称量5g脱脂乳，溶于90mLPBST溶液中，加热煮沸，定容至100mL；PBST洗涤液：1000mL10mmol/L pH 7.4的PBS中加入0.5 mL Tween-20；HRP标记的兔抗牛IgG结合物：购于北京博鳌森生物技术有限公司。

底物溶液：

A 液：TMB（3、3’、5、5’—四甲基联苯胺）200 mg，无水乙醇100 mL，加双蒸水，至1 000 mL。

B液：（100 mmol/L柠檬酸-200 mmol/L Na2HPO4缓冲液，pH5.0～5.4）：柠檬酸 9.33 g，Na2HPO414.6 g，加三蒸水至1 000 mL，调pH至5.0～5.4。

临用前分别取A液、B液各5mL，混匀，加入50μL的30%H2O2。

终止液（2 mol/L H2PO4）：分别取蒸馏水600 mL和浓硫酸100 mL，混匀，定容至900 mL。

移液枪；酶标仪：SynergyTM4，美国伯腾仪器有限公司；磁力分离板：天津倍思乐色谱技术开发中心。

1.2 方法

1.2.1 封闭液及待检血清最佳稀释度的确定

吸取100 μL gp51肽偶联免疫磁珠于酶标板中，放在磁力分离板上，吸弃上层清液。加入不同种类封闭液：5%猪血清、5%脱脂乳，5%羊血清 100 μL/孔，37℃孵育30 min后，放在磁力分离板上，吸弃上层清液，PBST 洗涤磁珠，1 min/次×2；分别加入已做 1 ∶50、1 ∶100、1 ∶200倍稀释的待检血清，100 μL/孔，37 ℃孵育30 min，放在磁力分离板上，吸弃上层清液，PBST洗涤磁珠，1 min/次×3。HRP兔抗牛IgG做1∶10 000倍稀释，37℃孵育 30 min，PBST 洗涤磁珠，1 min/次×3次；加入底物，37℃反应10 min后，在酶标仪上读出OD450 值，选择当阳性血清＞0.750，阴性＜0.250 时，P/N最大的封闭液和血清稀释度为工作浓度。

1.2.2 HRP兔抗牛IgG最佳工作浓度的确定

吸取100 μL gp51肽偶联免疫磁珠于酶标板中，放在磁力分离板上，吸弃上层清液，加入最佳封闭液，封闭结束后，放在磁力分离板上，吸弃上层清液，加入最适稀释度的血清，37℃孵育30 min，放在磁力分离板上，吸弃上层清液，PBST洗涤磁珠后，分别加入按1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000倍比稀释的 HRP 兔抗牛IgG，37℃孵育 30 min，PBST 洗涤磁珠，1 min/次×3次；加入底物A、B液，37℃反应10 min后，在酶标仪上读出OD450值。选择当阳性血清＞0.750，阴性血清＜0.200时，P/N最大的抗体稀释度为工作浓度。

1.2.3 与相关检测方法的对比分析

Svanova公司BLV gp51-Ab试剂盒法，实验步骤见试剂盒说明书。

本实验方法：吸取100 μL gp51肽偶联免疫磁珠于酶标板中，放在磁力分离板上，吸弃上层清液。加入5%猪血清封闭液100 μL/孔，37℃孵育30 min后，放在磁力分离板上，吸弃上层清液，PBST洗涤磁珠，1 min/次×2；分别加入已做1∶50倍稀释的待检血清，100 μL/孔，37 ℃孵育 30 min，放在磁力分离板上，吸弃上层清液，PBST 洗涤磁珠，1 min/次×3；HRP 兔抗牛IgG做1∶10 000倍稀释，37℃孵育30 min，PBST洗涤磁珠，1 min/次×3次；分别加入底物 A、B 液，37℃反应10 min后，在酶标仪上读出OD450值。

2 结果分析

2.1 不同血清稀释度及封闭液ELISA结果

选取三种封闭液：5%猪血清、5%羊血清、5%脱脂乳，待检牛血清按 1 ∶50、1∶100、1∶200 倍比稀释，与封闭液组成方阵，按照以上步骤进行ELISA，结果见表1。

表1 不同血清稀释度及封闭液ELISA结果Table 1 Results of different serum samples and blocking solutions

从表1中可看出，用5%猪血清或5%的脱脂乳做封闭液，随血清稀释度的增加阳性血清及阴性血清OD450值显著下降，同一血清稀释度下，用5%猪血清或5%的脱脂乳封闭，阳性血清OD450大致相同，阴性血清OD450：5%猪血清＜5%的脱脂乳。5%脱脂乳封闭时，阳性血清OD450值明显低于5%猪血清或5%的脱脂乳封闭，阴性血清OD450值大致相同。故羊血清的封闭效果不如猪血清或脱脂乳，而猪血清对阴性血清的封闭作用优于脱脂乳。不同封闭条件下的P/N：5%猪血清＞5%脱脂乳＞5%羊血清。因此，得到符合条件的组合为：5%猪血清封闭，血清1∶50倍稀释。

2.2 不同兔抗牛IgG稀释度ELISA结果

采用5%猪血清封闭，待检血清做1∶50倍比稀释，把HRP兔抗牛IgG分别做1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000倍稀释，按照以上步骤进行ELISA，结果见表2。

表2 不同兔抗牛IgG稀释度ELISA结果Table 2 Results of different HRP-labeled rabbit anti-cow IgG

本实验的判定方法为：当血清的OD值＞0.750时判断为阳性，血清OD值＜0.250时判断为阴性，若有疑似血清，判断P/N值，当P/N值≥3时判断为阳性，P/N值＜3时判断为阴性。

2.3 Svanova公司BLV gp51-Ab试剂盒与本实验方法检测牛血清结果

选取41份牛血清，分别采用国外Svanova试剂盒和本实验方法进行检测，比较检测结果，见表3和表4。

表3 BLV gp51-Ab试剂盒检测血清结果Table 3 Results of BLV gp51-Ab kit to serum

根据试剂盒说明，当PP≥15时，判断为阳性，当PP＜15时，判断为阴性。由表3中我们可以看出阳性血清为 6 份，血清编号分别为 0091，0247，0026，0113，0141，0138。阴性血清为35份。

表4 液体磁流芯片法检测血清结果Table 4 Results of magnetic fluid chip method to serum

根据本实验方法，当OD值＞0.750时判断为阳性，当OD值＜0.250时，判断为阴性。由表4可知，检出阳性血清 6 份，分别为 0091，0247，0026，0113，0141，0138。其中，疑似血清为3972，3278，0171，进一步采用P/N值法判定，血清3278和3972的P/N值＜3，判断为阴性；血清0171的P/N值＞3，判断为阳性。Svanova公司BLV试剂盒检测出的阳性血清本实验方法均检测出来。BLV试剂盒检测血清0171为阴性，而本实验方法检测为阳性。两种方法检测到的阳性血清符合率100%，阴性血清符合率为97.5%。我们可以判定此方法可用于牛白血病病毒的检测。

表5 与Svanova试剂盒检测结果的比较Table 5 The result comparation of magnetic fluid chip method and BLV gp51-Ab kit

3 结论与讨论

牛白血病病毒是引起EBL的一种外源性逆转录病毒。该病毒感染牛后，牛体内细胞结构蛋白抗囊膜糖蛋白抗原gp51可对其产生强烈的免疫应答，本实验室根据对gp51蛋白表位的分析预测和磁珠偶联技术，制备了gp51肽偶联免疫磁珠，通过对封闭液、血清稀释浓度和HRP兔抗牛IgG工作浓度的筛选和优化，建立了针对牛白血病的液体磁流芯片检测方法。本方法可同时对40个样品进行测定，检测时间为2 h～3 h，通过与Svanova公司gp51-Ab试剂盒进行测定比较，表明2种方法检测到的阳性血清符合率为100%，阴性血清符合率为97.1%。因此，本方法可完全替代国外试剂盒检测方法，降低检测费用，摆脱了长期对国外试剂盒的依赖。

在研究过程中，主要采用移液枪、磁力架等简单设备及手工操作，因操作人员及手法熟练程度的差异，初期常出现洗涤过程中偶联磁珠部分流失的问题，出现部分孔结果重复性不好的问题，需要对操作人员进行短期的技术及操作要领培训。如果采用自动化的磁流洗涤设备，可明显减少误差，进一步提高检测准确率和重复性。

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