苹果醋饮料生产工艺的研究

赖颖，赵锦慧

（周口师范学院生命科学系，河南周口466001）

苹果醋是近年来苹果综合利用开发出的新产品，其用途非常广泛，可作为高档调味品、醋酸饮料、制成各种类型的保健品以及用于医疗行业等[1-3]。将苹果加工成果汁后酿制的苹果醋，苹果中全部的有营养价值的物质都分散其中。一般粮食醋中钾元素、锌元素等微量元素不足，而苹果醋可以补充这些微量元素，而且苹果醋中的维生素、氨基酸、多糖的含量也比较丰富，提高了食用醋的营养价值和保健功能[4-7]。另外，苹果是我国主要水果产品之一，2011年产量达到3 500 t，占世界产量近50%。我国苹果主要以鲜食为主，苹果加工的主导产品是苹果浓缩汁，产品较为单一，用于加工的苹果不到产量的10%，而苹果的产量还在逐年上升，造成苹果产区卖果难的问题，农民增产不增收，严重影响农民的生产积极性。因此，苹果醋的开发生产对充分利用苹果资源、提高果农收入、丰富醋饮料市场、节约粮食促进产果区经济发展有着重要的意义[8-12]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品

水晶富士苹果、海天陈醋：市售；发酵性结合酵母菌：发酵工程实验室提供。

1.1.2 试剂

95%酒精，无水乙醇，葡萄糖，蔗糖，酵母膏，高锰酸钾，氯化钠，琼脂，碳酸钙。

1.1.3 仪器

九阳水果榨汁机；蒸馏装置；高压蒸汽灭菌锅；恒温培养箱；可见分光光度计。

1.1.4 培养基

醋酸菌分离纯化平板培养基：葡萄糖1 g，酵母膏1g，碳酸钙2g，琼脂2g，0.04%溴甲酚紫 5mL，水 100mL，121℃灭菌30 min，冷却至70℃加入无水乙醇4 mL。

醋酸菌液体种子培养基：葡萄糖1 g，酵母膏1.5 g，磷酸二氢钾 0.05 g，硫酸镁 0.05 g，水 100 mL，pH 6.5，121℃灭菌30 min，冷却至60℃以下加无水乙醇3.5 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 醋酸菌的分离

将市场买来的海天陈醋分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，把每个稀释倍数分别取 0.2 mL 涂布到分离纯化培养基上，并做下标记，在30℃恒温箱培养3 d。

1.2.2 醋酸菌的纯化

挑选醋酸菌分离培养基上的黄色菌落，用接种环挑取，在醋酸菌纯化培养基上划“Z”字形，在30℃恒温箱培养得纯化的醋酸菌。

1.2.3 苹果汁的制备

用高锰酸钾溶液清洗苹果，切成小块后浸入1%氯化钠溶液护色。把处理好的苹果块放入榨汁机并加入果胶酶（使粉碎的苹果多出汁）和VC（防止苹果被粉碎后氧化褐变），榨成果汁。

1.2.4 苹果汁糖度测定和调整

苹果汁糖度测定采用蒽酮比色法。

1.2.5 酒精发酵正交试验

正交设计依据表1数据进行。

表1 酒精发酵正交条件设计Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of alcoholic fermentation

将称量好的活性干酵母加入10倍体积5%蔗糖溶液中于30℃恒温中活化30 min，每隔10 min搅拌一次。对调整过糖度的苹果汁依据表2设定的条件进行酒精发酵正交试验，发酵在250 mL锥形瓶进行，每个反应体系为200mL。首先将苹果汁在80℃灭菌30min，然后根据正交接种，最后放入各自恒温培养箱进行发酵，每天测酒精度。重铬酸钾比色法测定酒精度：

1.2.6 醋酸发酵正交试验

醋酸发酵正交试验基本条件设定如表2所示。

表2 醋酸发酵正交条件设计Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment of acetic acid fermentation

将活化的醋酸菌接种到种子培养基，在30℃培养12 h，得到醋酸种子液，再把种子液接种到经调整的醋酸发酵液中进行醋酸发酵。醋酸发酵产醋酸量用酸碱滴定法，采用0.1 mol/L的NaOH溶液对稀释十倍的醋酸发酵液进行滴定，依据滴定结果确定各试验体系的产酸量。

2 结果与分析

2.1 醋酸菌分离纯化结果

在醋酸菌分离纯化培养基上出现的黄圈的菌落即醋酸菌菌落，再经镜检确认。其原理为：醋酸菌可以产生醋酸使周围pH降低，而溴甲酚紫在碱性条件下显紫色，在酸性条件下显黄色如图1。

图1 醋酸菌分离Fig.1 Isolation of aceticacid bacteria

分离纯化得出的醋酸菌经革兰氏染色镜检，单生、成对偶尔成短链，细胞端平，革兰氏阳性，亚极生的单鞭毛，无芽孢，见图2。

图2 醋酸菌纯化Fig.2 Purification of aceticacid bacteria

2.2 酒精发酵条件的确定

依据表2设计正交试验结果如表3所示。

表3 酒精发酵正交试验结果与分析Table 3 Results of orthogonal experiments for alcoholic fermentation

续表3 酒精发酵正交试验结果与分析Table 3 Results of orthogonal experiments for alcoholic fermentation

由表3中RB＞RC＞RA可知影响酒精发酵3个因素的主次关系是B（糖度）＞C（酵母接种量）＞A（发酵温度），最佳组合条件为A1B3C2，即发酵温度27℃，糖度20%，酵母接种量8%。在酒精发酵过程中，选取糖度20%，接种量选取8%，在27℃恒温培养箱发酵，每天测得的酒精度，结果见图3。

图3 酒精度随时间变化曲线Fig.3 Change curves of alcohol content with time

在糖度和温度一定的条件下，随发酵时间延长酒精度呈现先增长后平稳趋势。在第4天时发酵液中酒精度达到最高；随时间延长酒精度呈平稳且缓慢下降趋势。根据以上结果，把酒精发酵时间设置为4 d。

2.3 醋酸发酵条件的确定

依据NaOH滴定法中的数据得出醋酸发酵产酸量以及醋酸转化率如表4所示。

表4 醋酸发酵正交试验结果与分析Table4 Results of orthogonal experiments for acetic acid fermentation

由表4的正交试验结果可知，影响产酸量的主次因素是初始酒精度＞装液量＞接种量；最佳条件组合为A’3B’1C’1，即初始酒精度 6%，接种量 20%，装液量40 mL，发酵温度30℃。影响酒精转酸率主次因素是A’＞B’=C’，最佳条件组合为 A’3B’1C’1，即初始酒精度6%，接种量20%，装液量40 mL，发酵温度30℃。

3 结论

本研究采用三角瓶液体发酵研究了苹果醋的发酵工艺特性，通过酒精发酵实验和醋酸发酵实验的研究，确定了苹果醋发酵的最佳工艺条件。在酒精发酵过程的研究中，以苹果汁为原料，最终确定的酒精发酵最佳条件：起始糖度为20%，发酵温度为27℃，活化的酒精酵母接种量为8%，发酵时间4 d。在所确定的最佳条件下进行酒精发酵实验，最终所测得的酒精度可达6.9%。在酒精发酵过程的研究中，确定了醋酸发酵的最佳条件。试验结果表明，最佳发酵条件为：初始酒精度6%（体积分数），接种量20%，装液量40mL，发酵温度30℃。

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