缫丝蚕蛹蛋白酶法水解条件优化

2014-07-25钟雨珅罗金凤黄先智丁晓雯

食品工业科技 2014年17期

钟雨珅，罗金凤，黄先智，丁晓雯

（1.西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400715;2.西南大学蚕学与系统生物学研究所，重庆 400715）

我国是世界最大的蚕茧生产国，年产鲜茧60余万吨［1］。蚕蛹是蚕茧缫丝后的主要副产物，蛋白质含量占干蚕蛹质量的45%～55%［2］。蚕蛹蛋白含有18种氨基酸，其中8种人体必需氨基酸的含量占氨基酸总量的40%以上，高于WHO/FAO提出的参考蛋白模式，且比例适当，被证实为一种优质、丰富的蛋白源［3－4］。在缫丝过程中，干蛹产量与茧丝量之比约为0.8∶1，即我国每年要产出12万吨以上的缫丝蚕蛹［5］。由于缫丝蚕蛹一般经过了高温和强碱等理化因素的作用，其感官、理化性质发生了劣变，目前主要用作动物饲料，在一定程度上降低了蚕蛹资源的附加值，也间接暴露出我国蚕桑产业的产品结构单一等问题。因此，如何更好地开发利用缫丝蚕蛹，提高其附加值成为了推动我国蚕桑产业发展的关键环节之一。

随着生物技术的发展，发现一些分子质量介于蛋白质和氨基酸的多肽具有极强的生物活性，如抗菌、增强免疫、抗氧化、降血压、降胆固醇、矿物结合、抗血栓、促生长、抑制肿瘤转移等作用［6－7］。这些生理功能是原蛋白所不具备或不可比拟的。通过酶解是制备生物活性肽的重要手段，同时酶解能够改善缫丝蚕蛹劣变的感官品质，这为缫丝蚕蛹蛋白的开发利用提供了新途径。

本文以缫丝蚕蛹蛋白为原料，通过多种酶单独或组合对其进行水解，研究获得最大水解度的酶解条件，以期为缫丝蚕蛹蛋白的深度开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

缫丝蚕蛹由重庆合川太和丝厂提供;缫丝蚕蛹蛋白自制，蛋白质含量77.31%;胃蛋白酶（酶活20万U/g）、胰蛋白酶（酶活20万U/g）Solarbio公司;中性蛋白酶（酶活10万U/g）、碱性蛋白酶（酶活20万U/g）、蚕蛹蛋白水解专用酶（酶活30万U/g）

南宁东恒华道生物科技有限公司;木瓜蛋白酶（酶活80万U/g）、风味酶（酶活3万U/g）、胰酶（酶活4000U/g）广西南宁庞博生物工程有限公司;其他常用试剂均为分析纯。

pHs－3C酸度计上海三信仪表厂;5810型台式高速离心机 Eppendorf中国有限公司;UV－2405分光光度计日本岛津（中国）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 缫丝蚕蛹蛋白酶解用酶的筛选以水解度为指标来确定酶解缫丝蚕蛹蛋白的较佳酶。

将脱脂缫丝蚕蛹蛋白粉过60目筛，用8种蛋白酶水解，探讨不同水解时间对水解度的影响。水解条件是生产厂商提供的各酶的最适水解条件，在恒温水浴中维持温度恒定，以1mol/L的HCl或NaOH维持pH恒定，水解条件如表1所示。

表1 单酶水解缫丝蚕蛹蛋白的水解条件Table 1 Hydrolysis conditions on silkworm pupa protein by single enzyme

分别酶解6h，然后于沸水浴中加热10min使酶灭活，流动水冷却酶解液，用纯水补足水解过程中蒸发的水分，4000r/min离心15min，收集上清液测定水解度。水解度计算公式［8］如下:

采用凯氏定氮法测定酶解液的总氮量［8］，双指示剂甲醛滴定法测定氨基酸态氮含量［9］。

1.2.2 缫丝蚕蛹蛋白酶解条件的优化

1.2.2.1 单因素实验优化酶解条件在研究一项实验条件时，固定其他实验条件不变，考察待研究因素变化对水解度的影响。

pH对水解度的影响:底物浓度5%，温度55℃，加酶量2%，采用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节水解体系的pH，设定pH 分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，酶解4h后灭酶离心，测酶解液总氮和氨基酸态氮含量，计算水解度。

底物浓度对水解度的影响:加酶量2%，温度为55℃，pH8.0，底物浓度分别为 1%、3%、5%、10%、15%、20%、25%，并按上述方法计算水解度。

加酶量对水解度的影响:底物浓度5%，pH8.0，温度55℃，加酶量分别为0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%，并按上述方法计算水解度。

温度对水解度的影响:底物浓度5%，加酶量2%，pH8.0，设温度分别为 45、50、55、60、65℃，并按上述方法计算水解度。

1.2.2.2 响应曲面法优化酶解条件的实验在单因素实验最佳水平左右的小范围内，以水解度为响应值（Y），用响应面法进一步优化酶解条件。根据中心组合实验设计原理，采用四因素五水平的响应面分析方法设计实验，分析因素与设计见表2。

表2 响应面分析因素与水平Table 2 Variables and levels in central composite design

1.2.3 数据处理方式每项实验重复3次以上，实验结果取平均值，采用Excel 2007、SPSS17.0进行数据分析，Excel 2007软件做图。

2 结果与分析

2.1 缫丝蚕蛹蛋白酶解用酶的筛选

酶解蛋白质所得多肽的生理活性与蛋白酶的种类和水解度［10］有密切关系。以水解度为指标，对实验用的8种蛋白酶是否适于缫丝蚕蛹蛋白的水解进行探讨，结果如图1所示。

图1 缫丝蚕蛹蛋白酶解后水解度的比较Fig.1 Comparison of the silkworm pupa protein hydrolysis degree

由图1可见，缫丝蚕蛹蛋白的酶解从开始至4h内，水解度的增加相对较快且达到较高的水平，并且还需综合考虑蛋白质品质和投入产出比的因素，因而后面的实验选用4h作为酶解时间。

不同蛋白酶水解缫丝蚕蛹蛋白4h时所得水解度的结果如图2所示。

对图2进行显著性分析的结果表明，在加酶量、底物浓度、酶解时间一定时，E7（蚕蛹蛋白水解专用酶）对缫丝蚕蛹蛋白的水解较其他蛋白酶具有显著优势。因此，以下将通过单因素实验和响应面法对E7水解缫丝蚕蛹蛋白的条件进行优化。

2.2 单因素实验对E7酶解缫丝蚕蛹蛋白条件的优化

2.2.1 pH对缫丝蚕蛹蛋白水解度的影响酶的活性部位由结合部位和催化部位组成，结合部位和催化部位的基团对反应体系的pH变化比较敏感［11－13］。用蚕蛹蛋白水解专用酶水解缫丝蚕蛹蛋白，pH对水解度的影响如图3所示。

由图3可知，当pH8.0时，底物浓度5%，加酶量2%，温度55℃时，E7对缫丝蚕蛹蛋白的水解度达到最大，为21.15%。这说明酶催化体系中作为底物的蚕蛹蛋白在pH8.0时表现出较好的解离状态。因此，选取pH8.0作为其较佳的酶解pH。

图2 缫丝蚕蛹蛋白酶解4h时水解度的比较Fig.2 Comparison of the silkworm pupa protein hydrolysis degree after 4hours of enzymolysis

图3 pH对缫丝蚕蛹蛋白水解度的影响Fig.3 The effect of pH on silkworm pupa protein hydrolysis degree

2.2.2 底物浓度对缫丝蚕蛹蛋白水解度的影响适当的底物浓度有利于反应向生成物方向进行。用蚕蛹蛋白水解专用酶水解缫丝蚕蛹蛋白，底物浓度对水解度的影响如图4所示。

图4 底物浓度对蚕蛹蛋白水解度的影响Fig.4 The effect of substrate concentration on silkworm pupa protein hydrolysis degree

由图4可知，当底物浓度为5%，pH8.0，加酶量2%，温度55℃时其水解度达到最大值，为21.15%。这说明当底物浓度低于5%时，氨基酸得率少，水解效率低;当底物浓度高于5%时，酶的稳定性下降，且酶活力也受到抑制。因此，选取5%作为较佳的底物浓度。

2.2.3 加酶量对缫丝蚕蛹蛋白水解度的影响在底物浓度一定时，底物的转化率取决于酶浓度，酶浓度越大，酶与蛋白质接触的几率增加，底物转化的能力也就相应增加［14］。酶解缫丝蚕蛹蛋白的酶用量对水解度的影响如图5所示。

图5 加酶量对缫丝蚕蛹蛋白水解度的影响Fig.5 The effect of additive amount of protease on silkworm pupa protein hydrolysis degree

由图5可见，在pH8.0，底物浓度5%，温度55℃时，在实验的加酶量范围内，当加酶量在2%以内时，水解度的增加很快;当加酶量超过2%后，水解度的增加趋缓。同时还需综合考虑酶的成本和目标水解度的要求，因此选取2%作为较适宜的加酶量。

2.2.4 温度对缫丝蚕蛹蛋白水解度的影响酶催化反应存在着最适温度。在最适温度以下，随着温度的升高，反应速度越快。如果超过酶的最适温度，将导致酶变性，使酶活性减弱甚至丧失［15］。缫丝蚕蛹蛋白酶解温度对水解度的影响如图6所示。

图6 温度对缫丝蚕蛹蛋白水解度的影响Fig.6 The effect of temperature on silkworm pupa protein hydrolysis degree

由图6可知，在 pH8.0，底物浓度5%，加酶量2%，当温度达到55℃时，水解度达到最大值，为21.15%。这说明55℃为酶的最适温度，当超过55℃时，维持酶分子结构的次级键解体，使得酶活性减弱甚至丧失。因此，选取55℃作为酶解的适宜温度。

通过单因素实验，得到蚕蛹蛋白水解专用酶酶解缫丝蚕蛹蛋白的最优条件是pH8.0，底物浓度5%，加酶量2%，温度55℃。

由于单因素优化方法是在其他因素不变的条件下，每次优化一个因素而得到的，忽略各因素间的交互作用。为了得到最优的酶解条件，在单因素实验的基础上，应用响应面法优化蚕蛹蛋白水解专用酶酶解缫丝蚕蛹蛋白的条件。

2.3 响应面法优化E7水解缫丝蚕蛹蛋白的条件

E7酶解条件的中心组合设计得到的实验结果见表3。

表3 响应面分析方案及实验结果Table 3 Scheme and results of response surface analysis

利用Design Expert 7.0软件对实验结果进行响应面分析，得出回归模型参数的方差分析见表4。

对响应值与各因素进行回归拟合后，得到的回归方程如下:

回归方程中各变量对响应值影响的显著性由F值来判断，概率p（F＞Fa）值越小，则相应变量的显著程度越高。模型p值小于0.01，表示模型高度显著，失拟项p=0.0631（＞0.05），影响不显著，说明未知因素对实验结果干扰小。R2=0.9907，说明模型拟合程度良好，实验误差小。因此，回归方程可以较好的描述各因素与响应值之间的真实关系。

表4 回归方程系数方差分析Table 4 The variance analysis of regression equation

pH和加酶量的p值均小于0.01，说明其对水解度的影响极显著;底物浓度和温度的p值大于0.05，说明其对水解度影响不显著;各交互项的p值均大于0.05，说明各因素间的交互作用对水解度的影响不显著，因此后面没有列出各因素的交互作用图;pH和加酶量的二次项对水解度的影响也是极显著的，而底物浓度和温度的二次项不显著。

由响应面优化结果可知，在水解时间为4h时，蚕蛹蛋白水解专用酶水解缫丝蚕蛹蛋白的最佳条件为:底物浓度为 7%，温度 53.09℃，pH7.2，加酶量3%，水解度预测值为22.09%。为了便于对实验条件进行控制，验证实验时将温度设为53℃，底物浓度为7%，pH7.2，加酶量为 3%，得到的实际水解度为21.44%，与预测值无显著差异（p＜0.05）。证明实验设计与分析方法是准确可靠的。

验证实验得到的最优水解度与单因素实验的结果（水解度21.15%）无显著差异（p＜0.05），这是由于在实验的范围内底物浓度和温度对水解度的影响不显著，各因素交互作用的对水解度的影响也不显著，说明单因素实验已得到了较好结果。在pH7.2～8.0，底物浓度 5%～7%，加酶量 2%～3%，温度53～55℃的范围内均可得到较高的水解度。