杨树生物能源真菌的筛选研究

赵桂华 蒋继宏 赵 楠

(1．江苏农林职业技术学院，江苏 句容 212400；2．江苏师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏 徐州 221000)

杨树生物能源真菌的筛选研究

赵桂华1,2蒋继宏2赵 楠1

(1．江苏农林职业技术学院，江苏 句容 212400；2．江苏师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏 徐州 221000)

为了筛选杨树上潜在的生物能源油脂真菌，对5种杨树的健康树皮、韧皮部、边材和叶片真菌组织进行分离和鉴定，并检测了菌丝和孢子内含油脂。结果表明,试验共分离 4 674 块组织，得到真菌菌落 4 501 个，占分离组织总数的96.3%，细菌菌落173个，占3.7%。其中非产油脂真菌菌落 4 043 个，占89.8%； 产油脂菌落458个，占整个菌落总数的10.2%。根据真菌的形态特征进行鉴定，其隶属于接合菌门、担子菌门和半知菌亚门10属，80%为半知菌亚门的真菌，其中，腐皮镰刀菌是一株高产油脂的真菌。产油脂真菌的出现与杨树种类和季节无相关性，而与真菌种类有关系。

杨树；生物能源；油脂真菌；筛选；鉴定

生物能源真菌，又称油脂真菌或脂肪真菌，是指在真菌个体中存在大量的油脂或脂肪体。真菌是绿色能源的一个全新发现，科学家们正在研究利用各种资源微生物，寻找和开发富产高油脂的微生物，这可能是解决部分能源的途径之一。如粉红粘帚霉(Gliocladiumroseum)可产生多种烃类组分的生物燃料，油脂酵母属(Lipomyces)、镰刀菌属(Fusarium)、被孢霉属(Mortierella)的油脂真菌可产生饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。随着我国用于农作物种植的土地资源不断减少，合理利用自然界的产脂微生物，将是今后长期的一项重要任务。真菌生物油脂的开发符合国民经济的可持续发展战略，可以缓解部分能源紧缺矛盾，备受各国重视。

由真菌、细菌和藻类产生的生物油脂，又称单细胞油质[1]。微生物细胞内合成和贮存的油脂超过细胞干质量的20%，称为产油微生物[2-3]，从产油微生物中提取的油脂称为微生物油脂。如斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)菌体油脂含量为52%[4]，有些微生物菌体油脂含量可达到60%以上[5-6]，菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina，MOD-1)不饱和脂肪酸含量为74.32%[7]。真菌油脂的主要成分是饱和脂肪酸(棕榈酸、硬脂酸)和不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸和棕榈油酸)[8]，如深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)的油脂内含有4.6%的花生四烯酸、5.78%～6.59%的C-亚麻酸[9]、 9.44%的γ-亚麻酸[10], 高山被孢霉(M.alpine)[11]、水霉(Saprolegoniasp.)和轮梗霉(Diasporangiumsp.)菌体内产生的油脂属于二十碳五烯酸(EPA)和ω-3多不饱和油脂酸[12]。科学家发现被孢霉属(Mortierella)、根霉属(Rhizopus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)能产生新的α-亚麻酸，一些低等丝状真菌成了α-亚麻酸的又一新来源。真菌是一种可再生的生物资源，一株优良的油脂真菌应具备营养简单、生长繁殖快、周期短、适应性强、能规模化培养、可连续生产等优点。

在真菌界五个亚门的真菌中，每一个亚门都有产油脂真菌；在子囊菌亚门中，科学家对内孢霉目(Endomycetales)的产油脂酵母菌的研究最多，其他几个亚门的产油脂真菌种类和数量有差异。国外对油脂真菌灰绿青霉(Penicilliumglaucum)的研究始于1894年，从该菌的分生孢子中提抽到了7%的油脂[13]。第一次世界大战期间，德国为了解决油源匮乏问题，利用产脂内孢霉(Endomycesvernalis)生产油脂，20世纪40年代发现斯达氏油脂酵母(Lipomicesstarkeyi)、胶粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、曲霉属(Aspergillus)及毛霉属(Mucor) 等高产油脂真菌[14-15]，后来在美国，日本，英国，法国分别对被孢霉属(Mortierellaspp.)[9]、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusaroum)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)以及酵母菌的产脂能力进行了研究[16]。我国对产脂真菌的研究主要集中在鞭毛菌[12,17-20]、接合菌[18,20-22]、子囊菌及半知菌亚门的交链孢(Alternariasp.)、曲霉(Aspergillussp.)、拟茎点霉(Phomopsissp.)[23]、菜豆壳球孢(Macrophominaphaseolina，MOD-1)[7]、茎点霉(Phomasp.)[24]和黑核桃(Juglansregia)内生真菌HJ1(无真菌名称)等方面[8]。

在过去的几十年里，我国报道的含油脂菌株大多数都是从土壤、水、农作物剩余物中分离得到，少数来自黑核桃[8]、意大利杨(Populuseuramevicana)[24]、桑树(Mulussp.)[7]等木本植物。本研究通过对5种健康杨树的组织分离、纯化、鉴定，从中筛选油脂含量高、具有开发潜力的真菌菌株，为今后的油脂开发提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

从2009年6月至2010年12月，分别在山东省费县、沂南县、沂水县和蒙阴县，江苏省泗阳县和句容市采集5～20年生的I-69杨(PopulusdeltoidesBartr. cv. Lux′)、I-72杨(P.deltoidesBartr. cv. ‘Lux’)、南林351杨(P.deltoidesharvard. ×P.deltoideslux)、I-107杨(Populus×euramericanaCL ‘74/76’)和南林895杨(Populus×euramericanacv. ‘Nanlin895’)的健康树皮、韧皮部、边材和新鲜叶片，带回实验室供组织分离使用。从江苏句容市到山东沂水县采集地位于北纬31°84′00″～35°54′00″，东经117°24′00″～120°68′00″, 海拔30～100 m，使用GPS测定采集地点的地理方位。

1.2 真菌组织分离法

取杨树的健康树皮、韧皮部、边材和叶片，用70%乙醇棉球擦3次后，在酒精灯上烧去多余的乙醇，用无菌的解剖刀切取组织进行分离[25]，每个样品分别分离40～50皿，每皿5～6块组织，放入(25±1)℃、RH 70%、黑暗的PRX-250A智能人工气候箱内培养。5 d后检查统计每种杨树上各类真菌出现的频率，并进行纯化培养，保留菌种待用。

1.3 菌丝和孢子内含油脂的检测方法

在PDA培养基上培养5～7 d的菌落，通过肉眼观察后，做成临时玻片在德国蔡斯ZEISS Imager.A1光学显微镜下观察(不染色)。以看到菌丝和孢子内有油脂球体存在为标准，再根据油脂颗粒大小和多少确定含油量的高低，对于富含油脂的菌株将进一步纯化保存。

1.4 真菌鉴定

在PDA上培养7 d后，观察菌落形态、颜色和生长速度，根据不同真菌的显微形态特征进行鉴定。

1.4.1 接合菌亚门和担子菌亚门的真菌培养 按照正常的PDA平板培养方法，在5～7 d内均可产生孢子。

1.4.2 丝孢纲真菌的培养 由于丝孢纲真菌不产生子实体，并在较短的时间内就能产生分生孢子梗和分生孢子，可采用载玻片培养法[26]培养1～3 d(因真菌种类不同，产生分生孢子的时间长短也不同)；能够很清楚的看到分生孢子梗和分生孢子的产生方式。

1.4.3 腔孢纲真菌的培养 在PDA培养基上，黑盘孢目和球壳孢目的真菌需要经过10～20 d的培养，待产生分生孢子盘或分生孢子器，并有成熟的分生孢子时，用徒手切片法或石蜡切片机将子实体切成10～15 μm厚度。

将以上3种培养方法产生的孢子做成临时玻片，在德国蔡斯ZEISS Imager.A1光学显微镜下观察接合菌亚门孢囊梗、孢子囊和孢囊孢子，担子菌亚门和半知菌亚门分生孢子梗和分生孢子的形成方式、大小、形状、颜色，并拍照、测量，根据各个菌株的形态特征进行鉴定[27-33]。不产生任何孢子的菌株和细菌暂未作鉴定。

2 结果与分析

2.1 油脂真菌的分离

不同种类的杨树或同一株杨树不同部位的真菌种类和数量稍有差异。本研究共分离 4 674 块组织，得到真菌菌落 4 501 个，占分离组织的96.3%，细菌菌落173个，占3.7%。在 4 501 个菌落中，非产油脂真菌菌落 4 043 个，占89.8%；产油脂菌落458个，占10.2%，5种杨树不同分离部位的产油脂菌株数量为6.3%～14.8%(表1)。

从各种杨树不同部位分离到的菌株镜检结果表明，虽然在任何部位都有可能存在产油脂真菌，但分布无规律，至于一些优良的产油脂真菌存在杨树哪一个部位，取决于真菌种类。

表1 不同杨树的油脂真菌分离

2.1.1 从菌落形态特征初步判断产油脂真菌 通过对菌落颜色观察，可以初步判断真菌菌丝内是否含油脂。大多数油脂含量较高菌落一般都会有白色、红色、淡黄色、黄色和深黄色(图1)，绒毛状的气生菌丝，仔细观察会发现菌落表面有类似小油点的亮光，这是镰刀菌(Fusariumspp.)和枝顶孢(Aremoniumspp.)的一些种类菌落特征，腐皮镰刀菌是一株高产油脂的真菌。少数无气生菌丝的、黑色菌落的菌丝内也含有较高油脂，如褐枣霉(Spadicoidesbina)、盾壳霉(Coniothyriumsp.)。

2.1.2 镜检确定含油脂真菌 确定产油真菌可采用菌落观察和显微镜检查相结合的方法。由不同真菌的镜检结果可以看出，每一种真菌产油脂数量，以及真菌在生长过程中产油脂时间均有明显差异。菌丝内油脂体的大小与产油量直接相关，油脂体的形状有球形、椭圆形、圆柱形、长方形、哑铃形(图2)，虽然不同真菌的油脂形状有差异，但在同一种真菌的菌丝内油脂形状和大小也不同，单个油脂体的大小为2.1～63.7 μm。在一个菌丝细胞内能产生一个至多个油脂体，且大小和形状不同。因真菌种类不同，故油脂体在菌丝内存在的状态也有差异，有的油脂体在菌丝内不易被压出来，如弯孢(Curvularialunata)、褐枣霉(S.bina)、镰刀菌(Fusariumspp.)等菌株；而有些真菌的油脂极易被从菌丝中压出来，如胶孢炭疽(Colletotrichumgloeosporioides)见图3。在显微镜下可见油脂体的颜色有深浅之分，可能与油脂种类、产生时间及不同观察面有关(图2)，甚至同一真菌的不同生长阶段(或培养时间)油脂含量也有差异，在大多数的含油脂真菌中，以培养(5±1)d油脂产生的数量最多。有些真菌油脂体小，数量多；而另一些真菌的油脂体大，数量相对少，油脂含量相对较高；特别是菌丝粗、油脂体大、数量多、不产生孢子的菌株应重点关注。同一种真菌可存在于不同的杨树上。

张晓昱等[13]用苏丹系列染色法确定真菌菌丝内的油脂体[20,34]，而本研究没有采用任何染色方法，只是通过菌落颜色和在光学显微镜下直接观察确定菌丝内油脂体存在，这样可初步筛选具有潜在开发应用潜力的优良菌株。

2.2 产油真菌鉴定

根据在显微镜下观察、测量的形态特征，对458个产油脂真菌菌株进行归类和初步鉴定。结果表明，其隶属于接合菌门、担子菌门和半知菌亚门的10属真菌(表2)，但以半知菌的种类最多。在孢球托霉属、鬼伞属、盾壳霉属、枣褐霉属中只分离到1个种，而在镰刀菌属、炭疽菌属、枝孢菌属中分离到多种产油脂真菌，可能将成为今后研究开发的潜在真菌。虽然有少部分真菌的油脂含量较高，因不产生孢子，故未作鉴定，也未在表2中列出。

2.3 产油脂微生物种类

据不完全统计，国内外文献记载的油脂真菌有34属，40种(不包括无种名的)；细菌1属1种，为嗜热油脂芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)，见表3。大量研究证明，能够产生油脂的微生物绝大多数是真菌，其中研究最多、最具有开发研究价值的是小克银汉属(Cuninghamella)、被孢霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)和酵母菌属(Lipomyces)。

表2 不同杨树上的产油脂真菌种类

表3 产油脂真菌和细菌种类

3 结论与讨论

从5种不同杨树上共分离 4 674 块组织，得到真菌菌落4501个，占分离组织的96.3%。通过菌落外观和镜检，确定产油脂菌落458个，占整个菌落总数的9.8%，证明在杨树的任何部位都存在不同种类的真菌和细菌。根据产油脂真菌菌株的形态特征进行鉴定，它们隶属于接合菌门、担子菌门和半知菌亚门的10属真菌，少部分真菌菌株的油脂含量较高，具开发潜力，其中，腐皮镰刀菌是一株高产油脂的真菌，绝大部分产油脂菌株在杨树上属于首次报道。

本研究使用的杨树只占到杨树种类的约5%，在其他杨树中还存一些具有开发潜力的产油脂真菌，随着研究水平不断提高和资金支持加大，将会给杨树生物产业发展带来新的利润增长点。杨树上产油脂真菌的价值，完全取决于研究开发能力。因此，杨树的价值可以通过销售木材和产油真菌应用后产生的效益来体现。

在菌株鉴定过程中，有少部分产油脂真菌不产生孢子，这给真菌的形态鉴定带来一定困难，但其中比较容易产生分生孢子的真菌具有更高的油脂含量，这种现象在真菌生长和孢子产生的过程中消耗了部分油脂，还是菌株之间存在差异有待研究。在过去的研究中发现，产油真菌与季节存在一定关系，在每年12月至翌年1月，有些常绿木本植物叶片上的产油真菌数量要比夏季多15%～20%，也可能是真菌体内储存油脂是为了抵抗外界的不良环境。在杨树上，冬季和夏季的含油脂菌株的数量变化不明显。

从人类社会发展的长远角度来看，高油脂真菌的开发应用将是今后研究的热点，也是解决生物能源的一条途径，特别是那些具有合成不饱和脂肪酸的真菌菌株的筛选更值得关注。用于生产的真菌须具备合成油脂的能力强，油脂积累量大，含油量稳定在50%以上。油脂产量的高低与真菌种类相关，卢东升等[48]研究结果证明，茶树上的高产油脂真菌集中存在拟茎点霉属(Phomopsis)及镰刀菌属(Fusarium)的菌株中，茶叶提取液可促进真菌油脂的合成。

真菌油脂主要以油脂体的形式贮存于细胞质中。近几十年来，由于人口增加和工业发展加快，人均耕地面积减少，对微生物油脂的研究开发越来越多，在欧洲、中东、南亚和澳洲等地已允许将某些微生物油脂添加到婴儿食品中[38]。伴随世界性能源物质的短缺，利用微生物油脂开发生产生物柴油和其他生物产品将会越来越引起人们的重视。

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(责任编辑 韩明跃)

Screening Bio-Energy Fungi fromPopulus

ZHAO Gui-hua1,2, JIANG Ji-hong2, ZHAO Nan1

(1. Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry, Jurong Jiangsu 212400, China; 2. The Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plants of Jiangsu Province, Jiangsu Normal University, Xuzhou Jiangsu 221000, China)

In order to screen some potential oleous fungi, fungus tissue of healthy bark, phloem, sapwood and leaf from fivePopuluswere isolated, and detection mycelia and grease content in spore. The results showed that there were 4 501 fungus colonies from 4 674 poplar tissues, accounting for about 96.3%, and bacteria colonies accounting for 3.7%. Among of them, no-oleous fungal colonies were 4 043, accounting for 89.8%, and oleous fungal colonies were 458, accounting for 10.2%. The authentication results of oleous fungals by morphological characteristics showed that, these oleous fungals belonged to Zygomycota, Basidiomycota and Deuteromycotina, and 80% of them belonged to imperfect fungi. Among them,Fusariumsolaniwas a fungus with high oil yield. No correlation between the fat producing fungi appeared andPopulusspecies and seasonal, but correlated to the fungal species.

Populus; bio-energy; oleous fungi; screening; identification

2014-07-07

国家自然科学基金项目(31170605)资助。

10.3969/j.issn.2095-1914.2014.06.001

S718.81

A

2095-1914(2014)06-0001-08

第1作者：赵桂华(1952—)，男，教授。研究方向：林木真菌。Email:172368691@qq.com。