灵芝多糖超声波提取工艺条件的优化

李凤林+吕艳荣+宫敬利+齐俊生

摘要：为确定灵芝（Ganoderma lucidum）多糖超声波提取最佳工艺条件，通过单因素试验与正交回归组合设计对其进行优化。结果表明，灵芝多糖超声波提取最佳工艺条件为料液比（g/mL）1∶35，超声功率80 W，超声温度50 ℃，超声时间35 min，此条件下灵芝多糖实际提取率为2.06%。

关键词：灵芝（Ganoderma lucidum）多糖；超声波提取；正交回归组合设计；工艺条件

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0640-04

灵芝（Ganoderma lucidum）为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝和紫芝的总称，以子实体为入药部位，具有补气安神、止咳平喘、扶正固本等功效，被《本经》称为上品[1]。灵芝的药用成分非常丰富，已分离得到的有效成分有数十种之多，其中多糖是灵芝中主要的生理活性物质之一，近年来引起国内外科研工作者极大的关注。现代药理学研究表明，灵芝多糖具有抗衰老、抗辐射、抗肿瘤、调节心律失常、镇静中枢神经、镇痛、强心、扩张冠状动脉、降低心肌缺血量、改善心肌微循环、降血糖、降血压、抑菌、提高免疫力、促进白细胞再生、保护肝细胞等多种生物活性[2-5]。多糖传统的萃取方法是水提法，存在着费时、耗能高、提取率低等缺点。超声波提取法是一种有效的新型提取方法，其空化作用能有效破碎细胞壁或者包埋结构的外层，改变物质扩散，释放内容物，从而提高提取率。目前，超声波技术已在植物多糖提取中被广泛应用，但目前鲜见关于超声波提取灵芝多糖的报道。本研究的目的是验证超声波法在灵芝多糖提取中应用的可行性，力求寻找出一种高效的提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 灵芝子实体采于吉林农业科技学院与吉林市汇丰科技开发有限责任公司合作基地（吉林市丰满区江南乡），为目前已培育定型的新品种（吉农汇特1号）。灵芝子实体切片后，用中药粉碎机粉碎，过40目筛备用。无水葡萄糖（分析纯）购于中国药品生物制品检定所；苯酚、浓硫酸、硝基水杨酸、乙醇等均为分析纯，由吉林农业科技学院食品理化实验室保存。

1.1.2 仪器与设备 KQ-100DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）， UV-1750型紫外可见分光光度计（岛津公司），RE-5299型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），SHB-III型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），YF型中药粉碎机（江阴市伟翔药化机械厂），DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），KDC-1044型低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 方法

1.2.1 灵芝多糖超声波提取方法 称取5.0 g灵芝子实体细粉，置于一定比例水中浸泡1 h，然后放在超声频率固定为40 kHz的超声波清洗器中，分别按照不同的萃取条件（不同的超声功率、温度及时间）提取，离心，留取上清液，并减压浓缩至30 mL，用Sevag法脱蛋白后加入2倍量的无水乙醇沉淀多糖，过夜，离心，得沉淀物，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤沉淀，干燥后称重，即得灵芝粗多糖。

1.2.2 灵芝多糖提取率的测定 多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法。以葡萄糖为标准品，480 nm波长下测定其吸光度，以葡萄糖溶液浓度（C，mg/mL）作横坐标，以吸光度（A）作纵坐标，绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性回归，得葡萄糖溶液浓度与吸光度关系曲线的回归方程：A=7.025C-0.004 9。R2=0.998 8，说明葡萄糖在规定范围内与吸光度呈良好的线性关系。

称取灵芝粗多糖干品2.0 mg， 用去离子水定容于50 mL容量瓶中，然后精确吸取样品溶液1.0 mL， 加入5%的苯酚溶液1.6 mL 及浓硫酸7.0 mL， 充分摇匀， 室温放置25 min 后于480 nm 测其吸光度。根据标准曲线及回归方程计算即得其多糖含量。灵芝多糖提取率（K）按下式计算：

式中，m为灵芝多糖质量（mg）；M为灵芝子实体细粉质量（mg）。

1.3 试验设计

针对影响灵芝多糖超声波提取效果的料液比、超声功率、超声温度及超声时间等条件，分别做单因素试验，然后采用正交回归组合设计（表1）试验优化灵芝多糖超波声提取工艺条件。

1.4 数据分析

采用DPS 3.01处理软件对试验结果进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 料液比对灵芝多糖提取率的影响

称取5.0 g灵芝子实体细粉，分别按料液比（g/mL，下同）1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入水浸泡1 h，然后在超声功率70 W，超声温度50 ℃，超声时间30 min条件下提取灵芝多糖，其结果见图1。由图1可见，随着溶剂比例的加大，灵芝多糖提取率逐渐上升，但当溶剂的比例超过30之后，灵芝多糖的提取率趋于平稳。分析其原因可能是由于在料液比达到1∶30时，多糖已大部分被提取出来。从能耗角度考虑，料液比选择1∶30较为适宜。

2.2 超声功率对灵芝多糖提取率的影响

称取5.0 g灵芝子实体细粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分别设定超声功率为50、60、70、80、90 W，在超声温度50 ℃，超声时间30 min条件下提取灵芝多糖，其结果见图2。由图2可见，随着超声功率的加大，灵芝多糖提取率逐渐上升，但超声功率超过80 W之后提取率反而下降。分析其原因可能是由于较高的超声功率加快多糖糖苷键的断裂而导致其降解，所以超声功率选择80 W左右较为适宜。

2.3 超声温度对灵芝多糖提取率的影响

称取5.0 g灵芝子实体细粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分别设定超声温度30、40、50、60、70 ℃，在超声功率70 W，超声时间30 min条件下提取灵芝多糖，其结果见图3。由图3可见，随着超声温度的升高，灵芝多糖提取率逐渐上升，但超声温度超过50 ℃之后提取率反而逐渐下降。分析其原因可能是由于较高的超声温度与超声波机械的协同作用下能使多糖的某些结构被破坏而降低了其提取率，所以超声温度选择50 ℃左右较为适宜。

2.4 超声时间对灵芝多糖提取率的影响

称取5.0 g灵芝子实体细粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分别设定超声时间10、20、30、40、50 min，在超声功率70 W，超声温度50 ℃情况下提取灵芝多糖，其结果见图4。由图4可见，随着超声时间的延长，灵芝多糖提取率逐渐上升，但超声时间超过30 min之后提取率反而逐渐下降。分析其原因可能是由于前期超声波对细胞壁的破坏，细胞内部的多糖物质向外扩散，从而释放更多的多糖；后期由于处理时间的延长，超声波本身对多糖有降解作用，其结构被破坏，所以超声时间选择30 min左右较为适宜。

2.5 正交回归组合设计试验结果

在单因素试验基础上，以多糖提取率为指标，采用正交回归组合设计优化灵芝多糖超声波提取工艺，其结果见表2。对结果的方差分析见表3。由表2结果可计算出拟合方程的各项系数，从而得到回归方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.011 67 x3+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42+0.006 25 x1x2-0.008 75 x1x3+0.003 75 x1x4-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4-0.006 25 x3x4。由表3可见，F2=16.166>F0.05（14，16）=2.35，说明回归显著，方程拟合良好；F1=3.884

以下是α=0.10显著水平剔除不显著项后，简化后的回归方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4。最高值的各个因素组合x1为1水平，x2为0水平，x3为0水平，x4为1水平，ymax=2.10，即优化灵芝多糖超声波提取工艺条件为料液比1∶35，超声功率80 W，超声温度50 ℃，超声时间35 min，此条件下灵芝多糖理论提取率为2.10%，用此条件重新进行验证，得灵芝多糖实际提取率为2.06%，与理论值较接近，进一步验证了本试验结果拟合得出的回归方程可以较好地应用于灵芝多糖的提取。

3 小结

1）在单因素试验的基础上，运用正交回归组合设计的理论与方法，通过DPS 3.01处理软件分析确定灵芝多糖超声波提取的最佳工艺条件为：料液比1∶35，超声功率80 W，超声温度50 ℃，超声时间35 min，此条件下灵芝多糖实际提取率为2.06%，与理论值较为接近，说明此回归模型是可靠的。

2）采用超声波辅助提取灵芝多糖具有时间短、温度低、提取率高、工艺简单等特点，该工艺可为灵芝多糖的工业化生产提供理论依据。

参考文献：

[1] 赵东旭，杨新林，王帮武，等.灵芝研究的若干进展[J]. 食用菌学报，1999，6（3）：59-64.

[2] ZHANG G L， WANG Y H， NI W， et al. Hepatoprotective role of ganoderma lucidum polysaccharide against BCG-induced immune liver injury in mice[J]. World J Gastroenterol，2002，8（4）：728-733.

[3] 白 丹，常迺滔，李大海，等.灵芝多糖抑菌活性初探[J].华北农学报，2008（S1）：282-285.

[4] 毛 健，马海乐.灵芝多糖的研究进展[J].食品科学，2010，31（1）：295-298.

[5] LI F L， ZHANG Y M， ZHONG Z J. Antihyperglycemic effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on streptozotocin-induced diabetic mice[J]. International Journal of Molecular Sciences，2011，12（9）：6135-6145.

2.4 超声时间对灵芝多糖提取率的影响

称取5.0 g灵芝子实体细粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分别设定超声时间10、20、30、40、50 min，在超声功率70 W，超声温度50 ℃情况下提取灵芝多糖，其结果见图4。由图4可见，随着超声时间的延长，灵芝多糖提取率逐渐上升，但超声时间超过30 min之后提取率反而逐渐下降。分析其原因可能是由于前期超声波对细胞壁的破坏，细胞内部的多糖物质向外扩散，从而释放更多的多糖；后期由于处理时间的延长，超声波本身对多糖有降解作用，其结构被破坏，所以超声时间选择30 min左右较为适宜。

2.5 正交回归组合设计试验结果

在单因素试验基础上，以多糖提取率为指标，采用正交回归组合设计优化灵芝多糖超声波提取工艺，其结果见表2。对结果的方差分析见表3。由表2结果可计算出拟合方程的各项系数，从而得到回归方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.011 67 x3+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42+0.006 25 x1x2-0.008 75 x1x3+0.003 75 x1x4-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4-0.006 25 x3x4。由表3可见，F2=16.166>F0.05（14，16）=2.35，说明回归显著，方程拟合良好；F1=3.884

以下是α=0.10显著水平剔除不显著项后，简化后的回归方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4。最高值的各个因素组合x1为1水平，x2为0水平，x3为0水平，x4为1水平，ymax=2.10，即优化灵芝多糖超声波提取工艺条件为料液比1∶35，超声功率80 W，超声温度50 ℃，超声时间35 min，此条件下灵芝多糖理论提取率为2.10%，用此条件重新进行验证，得灵芝多糖实际提取率为2.06%，与理论值较接近，进一步验证了本试验结果拟合得出的回归方程可以较好地应用于灵芝多糖的提取。

3 小结

1）在单因素试验的基础上，运用正交回归组合设计的理论与方法，通过DPS 3.01处理软件分析确定灵芝多糖超声波提取的最佳工艺条件为：料液比1∶35，超声功率80 W，超声温度50 ℃，超声时间35 min，此条件下灵芝多糖实际提取率为2.06%，与理论值较为接近，说明此回归模型是可靠的。

2）采用超声波辅助提取灵芝多糖具有时间短、温度低、提取率高、工艺简单等特点，该工艺可为灵芝多糖的工业化生产提供理论依据。

参考文献：

[1] 赵东旭，杨新林，王帮武，等.灵芝研究的若干进展[J]. 食用菌学报，1999，6（3）：59-64.

[2] ZHANG G L， WANG Y H， NI W， et al. Hepatoprotective role of ganoderma lucidum polysaccharide against BCG-induced immune liver injury in mice[J]. World J Gastroenterol，2002，8（4）：728-733.

[3] 白 丹，常迺滔，李大海，等.灵芝多糖抑菌活性初探[J].华北农学报，2008（S1）：282-285.

[4] 毛 健，马海乐.灵芝多糖的研究进展[J].食品科学，2010，31（1）：295-298.

[5] LI F L， ZHANG Y M， ZHONG Z J. Antihyperglycemic effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on streptozotocin-induced diabetic mice[J]. International Journal of Molecular Sciences，2011，12（9）：6135-6145.

2.4 超声时间对灵芝多糖提取率的影响

称取5.0 g灵芝子实体细粉，按料液比1∶30浸泡1 h，分别设定超声时间10、20、30、40、50 min，在超声功率70 W，超声温度50 ℃情况下提取灵芝多糖，其结果见图4。由图4可见，随着超声时间的延长，灵芝多糖提取率逐渐上升，但超声时间超过30 min之后提取率反而逐渐下降。分析其原因可能是由于前期超声波对细胞壁的破坏，细胞内部的多糖物质向外扩散，从而释放更多的多糖；后期由于处理时间的延长，超声波本身对多糖有降解作用，其结构被破坏，所以超声时间选择30 min左右较为适宜。

2.5 正交回归组合设计试验结果

在单因素试验基础上，以多糖提取率为指标，采用正交回归组合设计优化灵芝多糖超声波提取工艺，其结果见表2。对结果的方差分析见表3。由表2结果可计算出拟合方程的各项系数，从而得到回归方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.011 67 x3+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42+0.006 25 x1x2-0.008 75 x1x3+0.003 75 x1x4-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4-0.006 25 x3x4。由表3可见，F2=16.166>F0.05（14，16）=2.35，说明回归显著，方程拟合良好；F1=3.884

以下是α=0.10显著水平剔除不显著项后，简化后的回归方程：y=2.062 86+0.078 33 x1-0.040 00 x2+0.087 50 x4-0.067 80 x12-0.072 80 x22-0.070 30 x32-0.061 55 x42-0.028 75 x2x3-0.016 25 x2x4。最高值的各个因素组合x1为1水平，x2为0水平，x3为0水平，x4为1水平，ymax=2.10，即优化灵芝多糖超声波提取工艺条件为料液比1∶35，超声功率80 W，超声温度50 ℃，超声时间35 min，此条件下灵芝多糖理论提取率为2.10%，用此条件重新进行验证，得灵芝多糖实际提取率为2.06%，与理论值较接近，进一步验证了本试验结果拟合得出的回归方程可以较好地应用于灵芝多糖的提取。

3 小结

1）在单因素试验的基础上，运用正交回归组合设计的理论与方法，通过DPS 3.01处理软件分析确定灵芝多糖超声波提取的最佳工艺条件为：料液比1∶35，超声功率80 W，超声温度50 ℃，超声时间35 min，此条件下灵芝多糖实际提取率为2.06%，与理论值较为接近，说明此回归模型是可靠的。

2）采用超声波辅助提取灵芝多糖具有时间短、温度低、提取率高、工艺简单等特点，该工艺可为灵芝多糖的工业化生产提供理论依据。

参考文献：

[1] 赵东旭，杨新林，王帮武，等.灵芝研究的若干进展[J]. 食用菌学报，1999，6（3）：59-64.

[2] ZHANG G L， WANG Y H， NI W， et al. Hepatoprotective role of ganoderma lucidum polysaccharide against BCG-induced immune liver injury in mice[J]. World J Gastroenterol，2002，8（4）：728-733.

[3] 白 丹，常迺滔，李大海，等.灵芝多糖抑菌活性初探[J].华北农学报，2008（S1）：282-285.

[4] 毛 健，马海乐.灵芝多糖的研究进展[J].食品科学，2010，31（1）：295-298.

[5] LI F L， ZHANG Y M， ZHONG Z J. Antihyperglycemic effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on streptozotocin-induced diabetic mice[J]. International Journal of Molecular Sciences，2011，12（9）：6135-6145.