布拉氏酵母菌对菌群失调樱桃谷肉鸭的修复作用

常超+马治敏+伍金娥

摘要：为了研究布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）对菌群失调樱桃谷肉鸭的修复作用，试验采用单因子随机分组设计，选取25只25日龄的健康樱桃谷肉鸭分为正常对照组和抗生素组，正常对照组自由饮水，抗生素组按200 mL/只饮用添加氨苄青霉素（300 mg/L）的水10 d，成功建立菌群失调模型。对菌群失调组按不同剂量饲喂布拉氏酵母菌，连续饲喂15 d，观察粪便中的菌群及血液学和免疫器官指数的恢复情况。结果表明，布拉氏酵母菌能成功修复菌群失调樱桃谷肉鸭肠道中的大肠菌群、乳酸菌和双歧杆菌，并可使其血液学指标和免疫器官指数恢复至正常水平。

关键词：布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）；菌群失调；血液学指标；免疫器官指数

中图分类号：S834；S816.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0627-04

由于抗生素作为促生长剂使用所引起的病原菌耐药性、菌群失调及在动物性食品中的残留等问题，世界上对取消饲用抗生素的呼声越来越高[1]。事实上，不少国家已限制或禁止在饲料中使用青霉素、链霉素、四环素、泰乐菌素、卡那霉素、庆大霉素等抗生素，对尚在使用的抗生素，特别是人畜共用的抗生素，也有严格的限制措施。国内外研究者纷纷致力于抗生素替代物的研究，各种饲料替代物层出不穷，代表性的替代物如微生态制剂、酶制剂、中草药、低聚糖、糖萜素等。微生态制剂是在微生态学理论指导下，调整微生态失调，保持微生态平衡，提高宿主健康水平的正常菌群及其代谢产物和选择性促进宿主正常菌群生长的物质制剂总称[2]。近年来，随着对微生态制剂的大量研究，微生态制剂产业快速发展起来。布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）是从印尼的荔枝（Litchi chinensis）果实中分离的，该菌株能在37 ℃的高温下生长。研究发现，该菌能释放有效的消化酶、提供优质蛋白质和营养要素，提高宿主的免疫防御、消化和营养吸收能力；还能防治病原体，调节宿主免疫应答，减少炎症等，抑制细菌毒素和增强营养要素的运输 [3]。因此，利用酵母菌作为抗生素的替代物在动物养殖业使用理论上是可行的。本试验通过建立抗生素引起的菌群失调的腹泻模型，研究该菌对这一病理模型的修复作用，对指导酵母菌的合理应用，推动这一绿色饲料添加剂的发展具有重要实践意义。

1 材料与方法

1.1 药品与菌种

氨苄青霉素，购自武汉市华顺生物技术有限责任公司；布拉氏酵母菌，法国百科大制药厂生产。试验时将布拉氏酵母菌分别配制成108 CFU/L（低剂量）、109CFU/L（中剂量）、1010 CFU/L（高剂量）菌悬液。

1.2 仪器与试剂

仪器：培养箱、灭菌锅、全自动生化分析仪等；培养基：双歧杆菌BS培养基、改良番茄汁培养基、麦康凯培养基，购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.3 试验动物与分组

樱桃谷肉鸭（1日龄），购自武汉市春江禽业有限责任公司。将25只樱桃谷肉鸭随机分成正常对照组（5只）、抗生素组（20只），饲养至25日龄开始建模试验，正常对照组自由饮水，抗生素组按在饮水中添加抗生素的方式给药，饮水中含氨苄青霉素量为300 mg/L，按200 mL/只限量饮水，饮完后自由饮水，连续饮用10 d。待菌群失调模型成功建立后开始修复试验，将其分为4组（每组5只），即自然恢复组，低、中、高剂量布拉氏酵母菌组，分别作如下处理：各剂量布拉氏酵母菌组每天按200 mL/只饲喂不同剂量的布拉氏酵母菌菌悬液，饮完后自由饮水，自然恢复组自由饮水，各组连续饮用15 d。菌群失调模型成功建立后开始饲喂布拉氏酵母菌记为修复试验的第一天。

1.4 饲养管理

按照常规肉鸭饲养方法，分0～3周龄和4～7周龄两个时期饲养。饲料配方如表1所示。试验前将鸭舍及附属用具用福尔马林和高锰酸钾消毒，保持门窗完好、排水通畅，通风保温性能好。全期笼养，自由采食。

1.5 检测指标及测定方法

1.5.1 菌群数量的测定 从建模试验开始后第二、五、九天早上9：00无菌采集每组鸭粪便标本各1.0 g，置于装有玻璃珠及99 mL生理盐水的三角瓶中混匀，然后连续10倍倍比稀释至10-5，分别取10-3、10-4、10-5稀释液各100 μL涂布于麦康凯培养基，37 ℃恒温培养箱培养24 h用于检测大肠菌群（Escherichia. coli）；用倾注法检测双歧杆菌（Bifidobacterium）和乳酸菌（Lactobacillus）：取1 000 μL稀释液分别加至含有双歧杆菌BS培养基、改良番茄汁培养基中，分散均匀，待培养基冷却后置于37 ℃厌氧培养72 h后测定。

1.5.2 血液指标的测定 于修复试验开始前后测定，随机采集抗生素组5只肉鸭的血液作为病理组的血液指标参数（病理对照组），饲喂布拉氏酵母菌后第15天分别采集正常对照组、饲喂布拉氏酵母菌各组肉鸭静脉血2 mL（采血前禁食12 h，仅供饮水），用离心管收集血液，3 000 r/min离心15 min制备血清，分装后于-20 ℃保存，送至武汉大学人民医院采用全自动生化分析仪测定下列指标：肌酐（Cr）、葡萄糖（Glu）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、尿素（Urea）、总胆固醇（TCh）、甘油三酯（TG）。用以分析酵母菌对血液指标的修复情况以及对机体的损伤情况。

1.5.3 免疫器官指数的测定 于饲喂布拉氏酵母菌修复试验的第15天对樱桃谷肉鸭进行空腹活体称重，采血后屠宰试验鸭，将剔除周围脂肪的胸腺、脾脏和法氏囊称重，并按以下公式计算免疫器官指数。

免疫器官指数=免疫器官质量（g）/活体质量（kg）

1.6 统计分析

试验数据利用EXCEL进行整理，采用SSPS 17.0软件进行数据统计分析，均值的多重比较采用Duncans法和LSD法，结果采用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 菌群失调模型的建立

按“1.3”试验设计饲养，于建模试验的第九天发现抗生素组发生腹泻。樱桃谷肉鸭粪便主要肠道菌群数量的检测结果见表2。由表2可见，樱桃谷肉鸭饮用氨苄青霉素的第九天，粪便中的大肠菌群、乳酸菌、双歧杆菌与正常对照组相比差异均达到显著水平（P<0.05），表明菌群失调模型建立成功，此时动物已经处于菌群失调的病理状态。

2.2 布拉氏酵母菌对肉鸭菌群失调的调整

建模成功后停止饲喂氨苄青霉素，按“1.3”分组，饲喂不同剂量布拉氏酵母菌组于修复试验的第三天和第15天分别取粪便测定各菌群的数量，以评价布拉氏酵母菌对菌群失调模型的修复情况，其结果见表3。由表3可以看出，在修复试验的第三天，饲喂布拉氏酵母菌各组的大肠菌群、乳酸菌均达到正常水平，与正常对照组差异不显著（P>0.05）；与正常对照组相比，饲喂布拉氏酵母菌各组双歧杆菌的数量在3 d内虽未完全上升到正常水平，但均高于自然恢复组，结果表明饲喂布拉氏酵母菌有助于菌群的恢复。在修复试验的第15天，饲喂布拉氏酵母菌各组大肠菌群均达到正常水平，与正常对照组相比差异不显著（P>0.05）；饲喂不同剂量的布拉氏酵母菌后，粪便中乳酸菌、双歧杆菌数量与正常对照组相比均呈上升趋势（P<0.05）。

2.3 布拉氏酵母菌对肉鸭血清指标的影响

由表4可知，病理对照组Glu、TCh、TG、Cr均显著低于正常对照组，而经饲喂不同剂量的布拉氏酵母菌后，上述指标均呈升高恢复的趋势；除中剂量组的TCh和中、高剂量组的TG低于正常水平（P<0.05）外，其他指标各剂量组均恢复至正常水平。

2.4 布拉氏酵母菌对肉鸭免疫器官指数的影响

由表5可以看出，菌群失调的樱桃谷肉鸭经高、中、低剂量的布拉氏酵母菌调整后，其胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数与正常对照组相比差异均不显著（P>0.05），表明其恢复至正常水平；而自然恢复组脾脏指数未能达到正常水平，与正常对照组相比差异显著（P<0.05）。

3 讨论

3.1 菌群紊乱模型的建立

动物肠道微生态系统中存在着大量的不同种类的微生物，这些微生物之间及微生物与宿主之间有着错综复杂而又相对稳定的关系。微生物和宿主之间的交互作用决定动物肠道中微生物群落的组成，宿主提供微生物栖息的场所，而微生物也提高了动物抵抗胃肠道感染的能力。在正常情况下，这些微生物之间存在着动态的平衡，但是如果受到外界因素如抗生素、激素、药物和同位素的作用、环境的改变及疾病感染等，均可以导致动物肠道的微生态失调，即菌群失调[4]。抗生素的使用不当已成为引起菌群失调的最常见诱因[5]。根据菌群失调的概念制定了菌群失调的标准：动物体内常见的有益菌是双歧杆菌与乳酸菌，最常见的条件致病菌是肠杆菌。微生态学的观点认为菌群重度失调的表现为原来的菌群大部分被抑制，只有少数耐药菌大量繁殖或者外来细菌占优势成为优势菌群所引起的感染。本试验采用在饮水中添加氨苄青霉素给药的方法，于试验第九天检测结果发现，与对照组相比，粪便中的大肠菌群显著增多，乳酸菌、双歧杆菌显著下降，表明建模成功。严梅桢等[6]给小鼠灌喂大量的大黄水煎液可引起小鼠肠道乳酸菌和双歧杆菌显著下降，造成小鼠肠道内菌群失衡。本试验结果与上述研究结果一致。

3.2 布拉氏酵母菌对肉鸭血清学指标的影响

本试验结果表明，菌群失调樱桃谷肉鸭经布拉氏酵母菌调整后其血清中ALB、GLB、Glu、TCh、TG、Cr的含量均得以提升，大部分指标达到正常的樱桃谷肉鸭血清中的含量（中剂量组的TCh和中、高剂量组的TG低于正常水平）。血清总蛋白包括血清中白蛋白和球蛋白，主要起维持血浆渗透压、作为营养物质的运输载体、保持组织蛋白动态平衡、修补组织、维持血液pH稳定的生理作用，总蛋白水平反应机体的营养和免疫状态。与菌群失调病理对照组相比，低剂量布拉氏酵母菌增加了肉鸭血清中的TP和ALB的含量，表明低剂量布拉氏酵母菌有助于改善氨苄青霉素造成的肉鸭免疫损伤状态。血糖的来源渠道有肠道吸收、肝糖分解和糖的异生，机体内血糖含量的高低主要和肠道吸收能力有关，摄食量减少会导致血清葡萄糖的减少。本试验中发现，在病理对照组血清中的Glu比正常对照组低，说明肉鸭摄食减少，血糖量不足，而通过一段时间的布拉氏酵母菌调整后，血糖水平上升，恢复至正常，其中高剂量的酵母菌升血糖的作用最强。血清中甘油三酯的降低可能说明肝脏脂肪合成减少，而调控脂肪合成的关键酶主要是乙酰辅酶A羧化酶（AAC）和脂肪合成酶（FAS）。Mohan等[7]研究发现益生菌能抑制肉鸡血清中的胆固醇。本试验结果表明，中剂量布拉氏酵母菌组与正常对照组相比在一定程度上降低了肉鸭血清中TCh和TG的含量，说明其增强了肉鸭机体的脂肪分解能力。临床试验表明，尿素氮、肌酐含量的升高提示试验动物存在肾脏损伤的可能[8]。各剂量组与正常对照组相比，肉鸭血清中的Cr和Urea含量无显著差异，提示布拉氏酵母菌对肉鸭肾脏不会造成损伤。

3.3 布拉氏酵母菌对肉鸭免疫机能的影响

鸭的免疫系统包括法氏囊、胸腺、骨髓、脾脏和淋巴结等。胸腺是细胞免疫的中枢器官，既可产生淋巴细胞又能合成和分泌胸腺激素；脾脏是禽类最大的外周免疫器官，在捕获和处理抗原方面具有十分重要的作用，是T、B淋巴细胞尤其是B淋巴细胞增殖并产生免疫应答的场所；法氏囊是禽类特有的体液免疫器官，参与全身的细胞免疫和体液免疫[9]。微生态制剂能够通过合成维生素、有机酸、氨基酸、醇类等物质来促进免疫器官的生长发育，同时微生物作为良好的免疫激活剂可促进动物免疫器官的生长和发育[10]。据研究，饲料中添加微生态制剂1 000 mg/kg，与对照组相比其法氏囊指数显著提高（P<0.05）[11]。本试验结果表明，与正常对照组相比，低、中剂量布拉氏酵母菌组胸腺指数和法氏囊指数有提高，但无显著差异。说明布拉氏酵母菌可以改善肉鸭的免疫机能，其中中剂量布拉氏酵母菌组的效果优于低、高剂量布拉氏酵母菌组。

4 小结

本试验连续在饮水中添加氨苄青霉素至第九天，发现抗生素组发生腹泻，粪便中大肠菌群、乳酸菌与双歧杆菌数量与正常对照组相比差异显著，成功建立了菌群失调模型。对菌群失调肉鸭连续饲喂布拉氏酵母菌15 d，能使菌群失调樱桃谷肉鸭肠道中的大肠菌群、乳酸菌和双歧杆菌恢复至正常水平，并可使其血液学指标和免疫器官指数恢复至正常水平，表明布拉氏酵母菌对菌群失调樱桃谷肉鸭可起到修复作用。

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4 小结

本试验连续在饮水中添加氨苄青霉素至第九天，发现抗生素组发生腹泻，粪便中大肠菌群、乳酸菌与双歧杆菌数量与正常对照组相比差异显著，成功建立了菌群失调模型。对菌群失调肉鸭连续饲喂布拉氏酵母菌15 d，能使菌群失调樱桃谷肉鸭肠道中的大肠菌群、乳酸菌和双歧杆菌恢复至正常水平，并可使其血液学指标和免疫器官指数恢复至正常水平，表明布拉氏酵母菌对菌群失调樱桃谷肉鸭可起到修复作用。

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本试验连续在饮水中添加氨苄青霉素至第九天，发现抗生素组发生腹泻，粪便中大肠菌群、乳酸菌与双歧杆菌数量与正常对照组相比差异显著，成功建立了菌群失调模型。对菌群失调肉鸭连续饲喂布拉氏酵母菌15 d，能使菌群失调樱桃谷肉鸭肠道中的大肠菌群、乳酸菌和双歧杆菌恢复至正常水平，并可使其血液学指标和免疫器官指数恢复至正常水平，表明布拉氏酵母菌对菌群失调樱桃谷肉鸭可起到修复作用。

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