狗牙根黑穗病病原菌的鉴定及其培养特性

罗海澜+王飞+马旭园+李新伟+刘少娟

摘要：狗牙根（Cynodon dactylon）是耕地、果园及其他草种草坪常见的恶性杂草，为探索其生物防治方法，试验从患黑穗病狗牙根穗部分离到一株真菌LHL1，对其进行分子鉴定及生物学特性研究。液体发酵培养确定其最佳碳源和氮源及最适pH；苯胺蓝染色、光学显微镜镜检法观察感病狗牙根各部位菌丝和孢子分布情况。结果表明，菌株LHL1为担子菌亚门（Basidiomycotina）黑粉菌目（Ustilaginales）黑粉菌属（Ustilago）；该菌的最佳碳源和氮源分别为甘油和水解乳蛋白，最佳pH为5；镜检结果显示在感病植株的叶鞘内表皮有大量菌丝及孢子分布，茎、叶及分蘖芽鞘表面均有孢子存在。

关键词：狗牙根（Cynodon dactylon）； 菌株LHL1；生物防治

中图分类号：S543+.9；S435.121.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）03-0575-05

狗牙根（Cynodon dactylon）又名百慕达，为禾本科多年生草本植物，匍匐茎发达，蔓延力强[1，2]，根状茎具有解热利尿、舒筋活血的作用，叶提取物具降低血糖、抗氧化的作用[3]。狗牙根目前作为草坪草种广受欢迎，但因其侵占性和再生性强，是耕地、果园及其他草坪草种的危害性杂草。

黑穗病是一种由幼苗期进行系统性侵染从而引发全株发病的病害，苗期侵染花期发病，花期穗上具充满孢子堆的病瘿[4]，感病花不能正常开花结子。狗牙根黑穗病的高发期在每年的7～9月，主要依靠孢子传播。狗牙根黑穗病致病菌通过来自种皮或土壤的越冬孢子产生菌丝侵染发芽种子的胚芽鞘，并扩散至整个植物组织；狗牙根黑穗病致病菌对狗牙根的种子萌发、出苗无影响，但对匍匐枝的生长、干物质总量的积累、竞争力都有明显的降低作用[5]。在中国有关狗牙根黑穗病致病菌的研究鲜有报道；在其他国家，早在20世纪70年代对狗牙根黑穗病致病菌有相关报道，但主要集中在不同碳源及抗生素对菌落形态的影响，以及氯霉素对狗牙根黑穗病致病菌呼吸链电子传递的影响等[6，7]。

狗牙根黑穗病致病菌可严重影响狗牙根草坪生长成坪，但对防除田园狗牙根杂草具有积极作用。本研究从漯河医学高等专科学校草坪患黑穗病狗牙根花穗上分离到一株真菌，对其进行了微生物学及分子生物学鉴定，以期为将狗牙根黑穗病致病菌开发成狗牙根生防菌提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株 菌株LHL1由实验室人员从漯河医学高等专科学校草坪感病狗牙根穗分离得到。

1.1.2 培养基、试剂和仪器 营养琼脂斜面培养基，马铃薯蔗糖固体培养基（每升成分：马铃薯20 g， 蔗糖20 g，琼脂18 g），马铃薯蔗糖液体培养基（每升成分：马铃薯20 g， 蔗糖20 g），基础培养基（用200 g马铃薯煮水后滤液定容至1 000 mL），1%酵母膏培养基；试剂均为分析纯；Pfu高保真酶、底物以及总DNA提取试剂盒均采用北京全式金生物技术公司产品。OLYMPUS Bx51型光学显微镜[奥林巴斯（中国）有限公司]。LGJ-18S型冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离纯化及保存

菌株分离：在超净台上将感病植株穗部轻轻接触马铃薯蔗糖固体培养基，使孢子脱落至培养基，28 ℃光照培养至长出菌落，再挑单菌落接种于另一个马铃薯蔗糖固体培养基，进行菌株分离纯化。获得菌株LHL1于营养琼脂斜面培养基4 ℃保存。

1.2.2 培养方法

活化培养：将保存于4 ℃营养琼脂斜面培养基的菌株 LHL1接种于直径9 cm的马铃薯蔗糖固体培养基上，28 ℃培养。

种子液培养：无菌条件下，用接种针从培养好的平皿中挑取单菌落接种于装有100 mL 马铃薯蔗糖液体培养基的 250 mL三角瓶中，在28 ℃，200 r/min振荡培养3 d。

摇瓶发酵培养：无菌条件下，按0.6%接种量吸取种子液转接于含100 mL马铃薯蔗糖液体培养基的250 mL三角瓶中，在28 ℃，200 r/min振荡培养。

1.2.3 不同培养基对LHL1菌落形态的影响 将菌株LHL1分别接种到8个1%酵母膏培养基上，并在其中7个培养基中分别添加3%蔗糖、4%葡萄糖、0.5%葡萄糖、3%果糖、3%麦芽糖、3%甘油、3%乳酸钙，28 ℃培养5 d观察菌落形态。

1.2.4 处理设置 在基础培养基中分别添加浓度为20 g/L的不同碳源：甘露糖、葡萄糖、果糖、甘油、麦芽糖、乳酸钙、蔗糖，28 ℃、200 r/min摇床培养7 d，以确定最佳碳源；20 g/L甘油+基础培养基中分别添加浓度为2 g/L的不同氮源：氯化铵、硝酸钾、尿素、甘氨酸、水解乳蛋白、酵母膏，以20 g/L甘油+基础培养基为对照（CK）；在马铃薯蔗糖液体培养基中用2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH调pH至4、5、6、7、8、9、10。所有处理设3个重复。

1.2.5 LHL1菌株ITS鉴定 ITS鉴定采用试剂盒提取并纯化LHL1菌株总DNA，对ITS保守序列进行PCR扩增获得目的基因片段。通用引物分别为ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），PCR反应体系如下：10×Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，引物各1 μL，Taq酶l μL （5 U/μL），模板DNA 1 μL，ddH2O补足至50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，54 °C退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 °C延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶进行电泳检验后送上海生工生物技术公司进行测序。

1.2.6 寄主体内菌丝及孢子分布检测 选取感病狗牙根的叶鞘内表皮、叶表、茎表、茎髓、根表、分蘖幼芽鞘内表皮进行菌丝及孢子镜检。用苯胺蓝溶液（0.5 g苯胺蓝，99 mL 蒸馏水，1 mL冰乙酸）染色10 min后光学显微镜下检测[8]。其中叶片染色前用无水乙醇进行脱色处理。

1.2.7 数据处理 检验正态分布和1-way ANOVA 检验处理间均值差异，显著性由统计软件Statistical Analysis System Version 8完成，用Microsoft Excel作图。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对菌株LHL1菌落形态的影响

根据“1.2.3”观察不同培养基对菌株LHL1菌落形态的影响结果见图1。由图1可见，显微镜下3种菌落的菌形状并无显著差异，多数为分裂生长的梭状菌体，少量菌丝。1%酵母膏培养基的菌落为覆膜状，浅褐色、边缘不规则（图1B）；1%酵母膏+3%甘油培养基的菌落为褐色褶皱的白毛绒状（图1C）；1%酵母膏+4%葡萄糖培养基的菌落为雪花状，白色、边缘毛绒状（图1A），其他培养基的菌落形态与图1A类同。

2.2 不同碳源对菌株LHL1生长量及菌形态的影响

不同碳源对菌株LHL1生长量的影响见图2。由图2可知，菌株LHL1在以甘油为碳源时生长量最大，其次为蔗糖、麦芽糖、甘露糖、葡萄糖、果糖，以乳酸钙为碳源时生长量最低。不同碳源对菌株LHL1形态的影响见图3。由图3可知，以乳酸钙为碳源时菌株LHL1多为丝状（图3A），由老菌丝萌发形成新的菌丝；以蔗糖为碳源时菌株LHL1多为长椭圆形，呈现出芽殖或假丝状（图3B），其他碳源的菌形态与图3B类同。这说明该菌在利用率较高的碳源上生长快，分裂旺盛；在利用率较低的碳源上生长慢，分裂少，多为丝状延伸生长。

2.3 不同氮源对菌株LHL1生长量及菌形态的影响

以甘油为碳源，添加不同氮源后对菌株LHL1生长量的影响见图4。由图4可知，与对照相比，20 g/L甘油+基础培养基中加入氮源除尿素外均能促进菌株LHL1的生长，其中又以水解乳蛋白促生长效果显著，其他依次为酵母膏、氯化铵、甘氨酸、硝酸钾。值得注意的是培养基中添加尿素后检测不到菌株LHL1的生长量，这可能与尿素导致培养基呈碱性有关。光学显微镜下观察菌的形态，不同氮源对菌的形态没有影响，菌体多为酵母状裂殖生长；中间膨大呈椭圆形两端细小，或一端膨大一端细小（图5）。

2.4 不同初始pH对菌株LHL1生长量及菌形态的影响

不同初始pH的马铃薯蔗糖液体培养基对菌株LHL1生长量的影响见图6。由图6可知，菌株LHL1在偏酸性环境中生长较好，当初始pH为4～7时生长量较高，初始pH为5时生长量最高；当初始pH偏碱性时，菌株LHL1生长量逐渐减少，初始pH为10时菌株LHL1生长量极低。这一结果与茭白狗牙根黑穗病致病菌生长适宜pH为5～6结果相符[9]。镜检发现（图7）pH 4～6时菌株LHL1多为椭圆形，少数一端生长菌丝；pH 7～9时，菌株LHL1多数两端生长菌丝。推测菌株LHL1适宜在弱酸性环境下生长，以分裂或出芽形式繁殖；在碱性条件下不利于其生长，分裂繁殖困难，菌体进行营养生长，两端生长出菌丝。

2.5 ITS片段的序列测定和进化树分析

本实验室于2009年分离到菌株LHL1，经柯霍氏法则确定该菌为狗牙根黑穗病致病菌，并对其进行分子生物学鉴定。用引物对菌株LHL1的 DNA做PCR扩增其ITS序列，扩增结果送上海生工测序。序列提交GenBank，获登录序列号JX477170。与NCBI上相似序列经BLAST比对的结果表明：该菌株与Ustilago属的Ustilago cynodontis UE的ITS序列相似度为95%，与 Ustilago tritici PDSUT2的ITS序列相似度为94%，与Basidiomycete sp. nasa47的ITS序列相似度为91%。根据比对结果，在GenBank中选取与ITS序列相似度高的菌株LHL1及狗牙根寄生菌构建系统发育树，结果显示，LHL1与Ustilago cynodontis UE构成一枝。进化分析结合形态分析确定菌株LHL1属担子菌亚门（Basidiomycotina）黑粉菌目（Ustilaginales）黑粉菌属（Ustilago）。

利用序列比对软件ClustalX 1.83和系统发育分析软件PHYLIP3.68使用Neigh-bor-Joining法构建系统进化树， TreeView软件示图如图8。

2.6 寄主体内LHL1菌丝及孢子分布

用苯胺蓝染色后对感病狗牙根的叶鞘内表皮、叶片表皮、茎表皮、茎髓、根表皮、胚芽鞘表皮分蘖进行镜检，结果见表1。由表1可知，感病植株叶鞘内表皮气孔处有大量菌丝及孢子分布（图9A），在叶鞘表面伤痕处菌丝和孢子集中分布（图9B）。这可能是表皮的破损有利于菌丝由内生长并产孢，也可能是外面的孢子更容易在破损处萌发存活；叶片表皮、叶鞘内表皮、茎表皮及胚芽鞘表皮分蘖有少量孢子和菌丝分布；茎髓有菌丝检出。这一结果表明该菌不仅在寄主穗部大量产孢，在寄主的叶鞘、叶、茎及胚芽鞘的表面都会产孢。在组织结构比较幼嫩的叶鞘内表皮和穗部大量产孢，其原因可能是组织结构幼嫩有利于菌丝突破叶表皮结构，穗部作为生殖器官营养物质更为丰富，穗部表面积大，有利于菌丝生长、产孢。

3 小结与讨论

本研究于2009年分离到菌株LHL1，经柯霍氏法则确定该菌为狗牙根黑穗病致病菌。结果显示，菌株LHL1在1%酵母膏中添加0.5%葡萄糖以及乳酸钙为碳源时，LHL1菌落形态呈雪花状，与前人报道的菌落形态为覆膜状不同[6]。此外，发现这两种培养基上的LHL1菌斑块不能传代生长，但将单菌落打散后用无菌水制成菌液再涂平板或划线培养即能生长，是否存在菌自身生长限制因素，需要另做探究。菌株LHL1最佳碳源和氮源分别为甘油和水解乳蛋白，这与玉米瘤黑粉菌、水稻黑粉菌生长的最佳碳、氮源不同[10，11]。试验中添加尿素菌株不能生长，pH为5时生长量最高，pH为10时菌体生长量最低，这也印证解释了添加尿素为氮源时菌株LHL1不能生长的现象。当环境条件适宜其生长时，菌呈长椭圆形，以酵母方式分裂生殖，生长旺盛；环境不适宜时菌多呈菌丝态，分裂生殖少，生长量较低。Durieu等[6]也描述了狗牙根黑穗病致病菌存在菌丝和类酵母两种形态，低糖、非发酵型糖、抗生素以及溴化乙锭可以诱导形成类酵母形态菌。本研究发现在不同碳源下，该菌落形态与Durieu等[6]报道的存在差异，可能由于不同时间和地理位置存在变种导致的。

早在上世纪70年代，国外有对狗牙根黑穗病致病菌的研究，由于当时的试验条件受限都未进行分子鉴定[6，7]，本研究中经ITS序列分析，确定狗牙根黑穗病致病菌属黑粉菌属。黑粉菌属类菌在人工培养基上难完成生活史并产生冬孢子，该菌属以冬孢子萌发产生双核菌丝入侵寄主幼苗生长锥，完成侵染过程。本研究中涉及到的多种固体和液体培基，菌株LHL1产生大量次生担孢子，未见冬孢子形式。后期研究其菌丝及几种孢子侵染寄主的能力，探究其开发生防菌潜力。

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早在上世纪70年代，国外有对狗牙根黑穗病致病菌的研究，由于当时的试验条件受限都未进行分子鉴定[6，7]，本研究中经ITS序列分析，确定狗牙根黑穗病致病菌属黑粉菌属。黑粉菌属类菌在人工培养基上难完成生活史并产生冬孢子，该菌属以冬孢子萌发产生双核菌丝入侵寄主幼苗生长锥，完成侵染过程。本研究中涉及到的多种固体和液体培基，菌株LHL1产生大量次生担孢子，未见冬孢子形式。后期研究其菌丝及几种孢子侵染寄主的能力，探究其开发生防菌潜力。

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