DNA指纹数据库在我国主要农作物种质资源中的应用

孔维国　王俊峰　丁汉凤

摘 要：农作物种质资源是国家重要战略资源之一。我国的农作物种质资源丰富并有着独特的地域性，农作物种质资源的DNA指纹数据库不仅在种子质量和专利权保护方面发挥着重要作用，在种质品种鉴定、农作物育种和农作物遗传作图等方面也起着积极作用。因此，构建我国农作物DNA指纹数据库对保护我国丰富的种质和基因资源有着长远意义。

关键词：DNA指纹数据库；农作物；种质资源；分子标记

中图分类号：S325 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0131-05

农作物种质资源是保障农业生产稳定的基础，也是人类未来生存和发展的先决条件，其在农业科学和生命科学研究领域中占有极为重要的地位[1]。目前，由于分子生物学特别是转基因技术在育种方面的应用，使种质资源展现了亲本利用的集中化和核心化趋势，出现了大量在形态上相似而只存在个别性状或基因差异的品种，传统形态学方法已无法进行准确的品种鉴定和纯度分析，加大了种质资源收集、整理、鉴定及品种选育的难度[2]。另一方面，目前国内种子市场存在部分以劣充优、以假乱真的现象，严重影响了优良品种的增产效益，给育种者和农业经济造成了巨大的损失[3]。因此，寻找一种安全有效、方便快捷、精确稳定的技术以鉴定种质资源的真实性和纯度显得尤为重要。近年来，我国政府高度重视作物种质资源信息系统的研究，在连续6个五年计划中，国家科技攻关项目均设立了专题研究，并取得重要进展。

1 DNA指纹数据库起源

随着现代分子生物学技术和电泳技术的迅猛发展，一种新的分子标记技术——电泳指纹图谱技术在农作物种质资源的亲缘关系鉴定、品种审定和杂优类群划分等方面发挥了很大的作用[4]。电泳指纹图谱技术分为蛋白质指纹图谱和DNA指纹图谱，较之前者，后者不受环境、生物发育时期、组织器官及基因表达等影响，遗传稳定、多态性高，且不影响目标性状的表现，因此更具优势，目前已被广泛用于农作物种质资源的鉴定[3]。DNA指纹图谱多态性丰富且具有高度的个体特异性和环境稳定性，它提供的是可见的条码式谱带图谱，可通过计算机进行系统管理，而由此构建的数据库就被称为DNA指纹数据库。2005年，国际植物品种权保护组织（UPOV）拟定的BMT测试指南草案中规定，将微卫星（Microsatellite），亦称简单序列重复（Simple Sequence Repeats， SSR）和单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms， SNP）等分子标记技术确定为构建DNA指纹数据库的标记方法。

2 我国农作物种质资源DNA指纹数据库的构建

建立DNA指纹数据库一般需要如下几个关键性因素：标记方法和标记来源，严格规范的检测平台，核心样品的选定，核心引物的选定，数据的整合和数据库的评估[5，6]。目前国内DNA指纹数据库的标记方法和来源一般是参照国际上的通用标准——SSR标记方法，个别的采用非主流方法和标准[7～9]。检测平台则因各个科研单位人员、技术和资金等因素的限制而有所不同，一般为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，个别资金充裕的单位采用毛细管电泳[5]。核心样品的选用因各地的研究方向不同而各有侧重[10，11]。核心引物的选用比较多样化，由于核心引物的选择不同，导致各个数据库在整合方面出现了一定的难度，这可能成为今后工作的重点之一。近年，我国已在小麦、玉米、水稻、大豆、花生、棉花等多个物种开展DNA指纹数据库的构建，并取得了重要进展。

2.1 小麦DNA指纹数据库构建

由于小麦基因组巨大，目前国际上该方面的研究主要停留在通过分子标记的方法对小麦的物理图谱进行测定，其大范围的物理图谱测定工作已基本完成[12]。我国在该方面的研究也进展迅速。1999～2000年，高睦枪等利用53对SSR标记对北方冬麦区及黄淮冬麦区观察谱中选出的48个新品种（系）进行了遗传差异研究，发现利用5个多态性高的SSR标记可以将48个小麦新品种（系）鉴定开[7]。2006年，中国农业科学院作物科学研究所联合国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）、国际干旱地区农业研究中心（ICARDA）和法国Agropolis研究所， 建立了包括134个SSR引物、 2 457个普通小麦基因型的指纹数据库[13]。2007年，王立新等采用15个SSR标记和20个AFLP-SCAR标记分析了来自我国不同麦区的455个小麦品种，证明用两种分子标记建立小麦DNA指纹可以更加全面地反应品种的遗传多样性，建立了构建DNA指纹的方法模式[8]。2013年，李莉等以山东省41份小麦种质资源为材料，使用46对SSR引物，构建了DNA指纹数据库[14]。

2.2 玉米DNA指纹数据库构建

国际上对玉米DNA指纹数据库的研究已取得了重要进展，其物理图谱已经覆盖了93.5%的玉米基因组[15]。而我国的玉米DNA指纹数据库的平台业已基本完成。2006年，北京市农林科学院玉米研究中心联合国内十多家科研单位开展了中国玉米品种DNA指纹库构建的研究工作，为了保证玉米品种DNA指纹库构建的标准化，从建库标记、检测平台、试剂、样品、评估程序、数据整合、模式库、扩展库和随机盲测9个方面进行了全面的规范，从而为科研单位合作开展大规模的DNA指纹库构建研究奠定基础[5]。2007年，王凤格等用玉米的10对核心引物对1 360份玉米品种进行建库工作，其中杂交种1 250份，包括本单位自育品种17 份、征集已知品种330份、国家区试及省区试品种855份、植物品种权保护品种48份[6]。2009年，郭长奎等通过4对核心引物对新疆8个主要玉米杂交种及其亲本的ISSR分析， 初步构建了新疆玉米DNA特异性指纹图谱，并建立了数字化特异性指纹数据库[9]。玉米DNA指纹数据库的构建是一个复杂的系统工程，为了保证数据库的标准化，需要建立起一套原则和规范。2010年，北京市农林科学院玉米研究中心经过3 年的开发研究，初步构建了我国玉米DNA指纹数据库管理系统（http：//www.maizeDNA.com），该系统具有数据管理、数据浏览和数据分析3 部分功能，通过将品种的基本信息、形态数据和图片、DNA指纹数据和指纹图谱等各种信息汇总起来，建立强大的联合查询系统[16]。endprint

2.3 水稻DNA指纹数据库构建

目前国际上比较流行的是基于BAC文库方法对水稻物理图谱进行研究，并在各个文库间进行比对[17]。由于我国拥有比较丰富的水稻种质资源，目前正处于对各种种质资源进行调查和整理的阶段。2009年，陈英华等从500对SSR引物中筛选出10对核心引物， 用于构建东北地区近两年区域试验水稻品种的DNA 指纹图谱，并在100对多态性位点上检测到300个等位基因[10]。2009年，三明市农业科学研究所的马红勃等以福建省三明市农科所选育、福建六三种业有限责任公司经营的24 份杂交稻品种和18份杂交稻亲本为材料， 依据中国水稻研究所推荐的12个SSR标记， 建立DNA指纹图谱[11]。2009年，中国水稻研究所的程本义等，利用前期研究建立的一套水稻品种DNA指纹检测技术体系，对2002～2006年浙江省主要的98个水稻品种以及2007～2008年155个浙江省区试水稻品种（181个次，含26个续试品种）进行了DNA指纹检测，构建了279个次水稻品种×12个微卫星标记的DNA指纹图谱数据库[18]。2010年，贵州大学马琳等，从145 对SSR引物中筛选出21对引物，对24份贵州地方水稻品种“禾”品种进行遗传多样性分析， 初步建立其DNA指纹图谱，并通过聚类分析将所有材料分为5 类， 聚类结果表明品种间的亲缘关系与地理来源关系不大[19]。

2.4 大豆和花生DNA指纹数据库构建

大豆DNA指纹数据库的构建在国际上一直都是热点，近年来出现了同时应用多种分子标记手段（SSR、RFLP、AFLP和STS）以完成其遗传连锁群测定的现象[20]。国内许多研究人员也通过不同分子标记手段在该方面取得一定进展。2001年，田清震等利用Mse Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切筛选适宜大豆AFLP指纹分析的引物组合，并利用17对引物组合建立了我国 92份代表性野生大豆和栽培大豆的AFLP指纹图谱[21]。2003年，关荣霞等以遗75-14、中黄14、中品662 和中品661共4个品种为试验材料， 利用不同连锁群上的SSR引物随机选择个体进行分析， 以确定分析品种纯度所需的引物数， 为大豆品种资源保存及品种指纹图谱建立提供理论依据[22]。2007年，王玉民等对大豆属Glycine亚属19份多年生野生大豆、Soja亚属2份野生大豆和2份栽培大豆进行了ISSR分析，构建了栽培大豆和野生大豆的比较指纹图谱[23]。

花生属于豆科类作物，但其遗传多样性相对较低，这一特征在一定程度上限制了该物种的育种工作。Holbrook于1993年建立了一个包含831个美国花生地方品种组成的核心种质资源库[24]。而国内的研究现阶段还处于花生SSR分子标记的开发阶段，在DNA指纹图谱的构建上有一定的应用。目前已经有800多个花生基因组SSR分子标记。2006年，仲恺农业工程学院的刘冠明等利用20个南方花生品种为材料，从64对SSR引物中筛选出4对构建DNA指纹图谱[25]。2007年，周桂元等选用110对SSR引物对21个花生变异株系进行SSR多态性分析，有5对引物在变异株系与对照品种之间表现出多态性[26]。2008年，姜慧芳等以中国花生种质资源数据库中记录的6 390份花生资源为材料，以其基本数据、特征数据和评价数据为信息，采用分层分组聚类以及随机取样与必选资源相结合的方法，构建了由298份资源组成的花生小核心种质，为进一步的DNA指纹数据库的构建奠定了基础[27]。

2.5 棉花DNA指纹数据库构建

国外对棉花DNA指纹图谱的研究也取得一定的突破，部分染色体指纹图谱构建已基本完成[22]。国内研究人员以前的工作主要停留在初级阶段，利用SSR引物对棉花栽培品种的亲本进行多态性分析，以筛选并通过标记区分各个品种或鉴定其纯度。2003年，刘勤红等筛选了217 对异源四倍体棉花的SSR 引物， 获得了十几个足以区分鲁棉研15 号父母本及其F1的标记位点， 为鲁棉研15号杂交种的纯度鉴定提供了一个准确、稳定和快捷、实用的方法[28]。随着研究的深入，研究人员逐渐开始构建DNA指纹数据库。2005年，秦利等从10对引物中随机挑选出3对引物对当前新疆主栽品种进行指纹图谱构建和杂交种纯度鉴定，3个标记可分别将3个杂交种与它们的亲本加以区分[29]。2009年，中国农业科学院棉花研究所以18份陆地棉和3份海岛棉品种为材料， 从78对棉花SSR引物中筛选出55 对具有多态性的引物， 并确定了33对棉种鉴定用的备选核心引物，构建了棉花品种DNA 指纹图谱[30]。2010年，中国农业科学院棉花研究所利用25对核心引物对中棉所48及其亲本进行多态性检测，构建了中棉所48 的数字指纹图谱[31]。

3 讨论

DNA指纹图谱技术不仅在种质品种鉴定、种子质量和保护专利权上发挥着重要作用，它也被应用到品种的亲缘关系划分、农作物育种和农作物遗传作图等方面[32，33]。但是，由于我国农作物DNA指纹图谱的研究才刚刚起步，国内各个研究机构水平不一，农作物的DNA指纹数据库构建所采用的技术、标准和软件等各不相同，同一农作物存在着若干个不同的DNA指纹数据库，且大多数数据库间存在不能兼容的现状[28～31]。这些情况的存在不仅不利于各个数据库之间的数据交换，造成资源浪费，更为重要的是它使农作物DNA指纹数据库间没有了统一标准，造成单个数据库容量不足、覆盖率不足、分辨率不足和不稳定等缺点，阻碍农作物DNA指纹数据库的构建和发展，影响研究人员对农作物分子育种工作的深入研究。目前国内仅有少数农作物形成统一标准，如中国水稻研究所国家水稻数据中心（http：//www.ricedata.cn）公布的水稻分子标记的信息和技术标准、我国玉米DNA 指纹数据库管理系统（http：//www.maizeDNA.com），而大多数研究仍是采取国际上的权威数据库。在数据库整合过程中，指纹图谱识别软件设计与开发滞后也是阻碍农作物DNA指纹数据库快速发展的重要原因之一，造成农作物DNA指纹数据库构建的半自动化，影响其构建速度和效率。由于我国农作物种质资源的独特性，同时也是为了保护我国丰富的种质和基因资源，构建自己的农作物DNA指纹数据库已迫在眉睫。因此，构建农作物DNA指纹数据库的基本平台、统一技术标准、加快相关软件开发已成为我国近期在该方面工作研究的重点，对于实现农作物DNA指纹数据库的标准化、自动化和数字化有着重要意义。endprint

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