基于量子点的赭曲霉毒素A sFLISA检测技术研究

2014-07-18房保海等

山东农业科学 2014年4期

房保海等

摘要：

建立了基于量子点标记技术的赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）双抗夹心荧光免疫检测（sandwich fluorescence-linked immunosorbent assay，sFLISA）体系，包含多克隆包被抗体、生物素标记的多克隆检测抗体、量子点标记的链霉亲和素等，获得了sFLISA的最佳操作参数：包被抗体浓度2.5 μg/mL，检测抗体稀释500倍，量子点标记链霉亲和素稀释100倍。该方法在OTA浓度3.125～125 μg/L之间时，相对荧光强度和OTA浓度呈线性关系，回归方程为y=0.0206x+0.2018，R2=0.9924；加标回收率在90.1%～110.0%之间，变异系数均小于10%，能较好地进行赭曲霉毒素A的定量检测。

关键词：赭曲霉毒素A（OTA）；量子点；双抗夹心荧光免疫检测（sFLISA）

中图分类号：R155.5+1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）04-0102-04

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是曲霉属和青霉属的某些菌种产生的次级代谢有毒产物，属烈性的肝脏和肾脏毒素，并具有致癌、致畸和致突变性[1～3]。OTA广泛存在于各种食物中，花生、谷物及其副产品是OTA 的主要来源，此外，在可可、咖啡、肉类、乳汁、干果、调味品、酒类中也存在OTA。这类毒素包括7种结构类似的化合物，其中毒性最大、对农作物污染最严重、分布最广泛的是OTA，OTA被证实有致癌、致畸、致突变的作用，还具有免疫抑制性，国际癌症研究机构LARC将OTA定位为2B类致癌物（即可能引起人类癌症的物质）[2，4] 。

OTA的产毒菌株广泛地存在于自然界中，在谷类和人血清等样品中都检出过OTA残留，严重危害人类的健康。由于OTA的危害性，各国都立法对食品中OTA的残留进行限定，至今已有多个国家制定了食品（1～50 μg/kg）和动物饲料（100～1 000 μg/kg）的OTA限量标准。及时进行检测和分析是预防和控制OTA危害的有效手段[5～7]。

量子点（Quantum dots，QDs），又称无机半导体纳米晶体，是一类由Ⅱ～Ⅵ 族（如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe 等）或Ⅲ～Ⅴ 族（如InP、InAs 等）元素组成的纳米颗粒，是近年发展起来的一种新型荧光纳米材料。与传统有机荧光染料相比，具有很多优良的荧光性能，吸收光谱宽、发射光谱窄而对称，斯托克斯位移（Stokes shift）大及较高的荧光稳定性和较长的衰减寿命[8～11]。现在，量子点是最重要的纳米材料之一，经常被用作生物标记及成像过程中的光学探针。

本研究利用多克隆抗体的强富集能力以及生物素-亲和素系统的放大作用，以量子点标记的链霉亲和素为荧光探针，巧妙设计了一种灵敏度高、特异性强的赭曲霉毒素A的双抗夹心荧光免疫捡测（sFLISA）技术，为赭曲霉毒素A在食品安全等应用领域提供技术基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

赭曲霉毒素A（中检维康，50 μg/mL，1 mL）；兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体（Global Biotech，250 μg/mL）；鼠抗赭曲霉毒素A抗体（生物素标记，Covalab，1 mg/mL）；量子点标记的链霉亲和素-605（QS605，武汉珈源量子点技术开发有限公司）；96孔酶标板（Thermofisher NUNC，黑色底透）。

1.2 主要仪器设备

多功能荧光酶标仪（SpectraMax M5）；6930型冷冻离心机（日本KUBOTA公司）；MS3涡流旋转振荡仪（德国IKA公司）；Eppendorf移液枪（0～200、0～1 000 μL）；冰箱[冷藏温度（4±1）℃]；恒温培养箱[（37±1）℃]。

1.3 sFLISA方法步骤

1.3.1 抗体包被用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液将兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体稀释成浓度为2.5 μg/L包被酶标板，每孔100 μL。42℃孵育5 h，倒去包被液，用PBST洗3次，3 min/次，甩干。其中一孔不加包被抗体而加包被缓冲液，作为试剂空白。

1.3.2 封闭用1× BSA-PBS溶液封闭板上的空白位点，每孔200 μL，37℃孵育1 h，倒去封闭液，用PBST洗3次，3 min/次，甩干。

1.3.3 加待检样品除试剂空白及另留1排孔作为阴性对照外，其余各孔加待测样品或倍比稀释的标准品各100 μL，阴性对照孔加100 μL的1× BSA-PBS，37 ℃孵育1 h，用PBST洗3次，3 min/次，甩干。

1.3.4 加生物素化抗体除试剂空白孔外，其余各孔加生物素化抗体100 μL，37℃孵育1 h，用PBST洗4次，3 min/次，甩干。

1.3.5 加量子点标记的链霉亲和素所有各孔加100 μL用TBS缓冲液适当稀释的量子点标记链霉亲和素，37℃孵育10 min，用洗涤液PBST洗4次，3 min/次，甩干。

1.3.6 荧光检测在多功能荧光酶标仪（SpectraMax M5）上390 nm激发波长，605 nm发射波长，选择底读模式，测量相对荧光强度（RFU，relative fluorescence units），减去试剂空白孔相对荧光强度，得到测量值。

1.4 检测限和重现性

在3.125～125 μg/L浓度范围内，以P/N>2.1作为判定阳性的标准，得到检测限。

选择3个OTA浓度（6.25、25和50 μg/L），每个浓度反复测定4次，计算相对标准偏差。

1.5 方法的特异性分析endprint

在sFLISA 最佳工作条件下，分别检测50 μg/L的黄曲霉毒素B1、BSA样品，检测抗体与被测物质的交叉反应程度。

1.6 加标回收

不含OTA的1 g花生粉中加入不同量的OTA标准品（6.25、25、50 μg/L），密封，室温过夜。次日按每管1 800 μL加入甲醇溶液（含0.01%乙酸）萃取1 h，10 000×g离心10 min后取上清液，加入等体积的PBS稀释，取100 μL按照1.3进行sFLISA测定，根据建立的标准曲线，推导出浓度值，计算添加回收率。

添加回收率（%）= 实测OTA含量/添加OTA含量×100

2 结果与分析

2.1 兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体包被浓度的优化

分别用浓度为0.5、1.25、2.5、5、10、20 mg/L的兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体包被酶标板，加入50 μg/L OTA标准品、1∶200稀释的鼠抗赭曲霉毒素A多克隆抗体（生物素标记）及1∶100稀释的量子点标记的链霉亲和素，同等条件下进行sFLISA，根据相对荧光强度值的变化选择适合的包被浓度。结果（图1）显示，0.5～2.5 mg/L时相对荧光强度值呈递增趋势，>2.5 mg/L后则趋于饱和，故本试验确定兔抗OTA多克隆抗体最适包被浓度为2.5 mg/L。

图1 兔抗赭曲霉毒素A多克隆抗体包被浓度的优化

2.2 鼠抗OTA多克隆抗体（生物素标记）浓度的优化

根据确定的一抗最适包被浓度包被酶标板，加入50 μg/L的OTA标准品、不同稀释倍数的鼠抗OTA多克隆抗体（生物素标记）及1∶100稀释的量子点标记的链霉亲和素，同等条件下进行sFLISA，根据相对荧光强度值的变化选择适合的第二抗体浓度。由图2看出，相对荧光强度值在1∶500之后呈递减趋势，故本试验确定鼠抗OTA多克隆抗体（生物素标记）适宜稀释倍数为1∶500。

图2 鼠抗OTA多克隆抗体（生物素标记）浓度的优化

2.3 量子点浓度的优化选择

根据确定的一抗最适包被浓度包被酶标板，加入50 μg/L的OTA标准品、1∶500倍稀释的鼠抗OTA多克隆抗体（生物素标记）及不同稀释倍数的量子点标记的链霉亲和素，同等条件下进行sFLISA，根据相对荧光强度值的变化选择适合的量子点标记的链霉亲和素。由图3可以看出，在1∶100之后呈递减趋势，sFLISA的相对荧光强度呈递减趋势，故本试验确定使用量子点标记的链霉亲和素适宜稀释倍数为1∶100。

图3 量子点标记链霉亲和素浓度优化

2.4 OTA sFLISA标准工作曲线的建立

将OTA进行梯度稀释，在优化的实验条件下，采用以上双抗体夹心FLISA法测定OTA。当OTA的浓度在3.125～125 μg/L范围时，OTA浓度与相对荧光强度之间呈线性关系（图4a）；线性回归方程为y=0.0206x+0.2018，线性相关系数R2=0.9924（图4b）。在此浓度范围内，OTA浓度可进行定量分析。

图4 OTA浓度与相对荧光强度的关系

2.5 检测限和重复性

在3.125～125 μg/L浓度范围内，以P/N>2.1作为判定阳性的标准，则OTA浓度的检测限为3.125 μg/L。

选择3个OTA浓度（6.25、25和50 μg/L），每个浓度反复测定4次。计算相对标准偏差分别为5.63%、2.77%、5.65%；回收率分别为95.9%、100.6%、109.5%（表1），具有良好的重复性。

2.6 特异性试验

采用该sFLISA法检测黄曲霉毒素B1和BSA时，测得的相对荧光强度平均值分别为0.080和0.070，与阴性值接近，且无显著性差异。表明该法检测赭曲霉毒素具有很好的特异性。

2.7 加标回收试验

通过加标回收的测定结果（表2）可知，建立的sFLISA 能够对3个不同浓度的OTA进行准确测定，回收率范围在90.1%～110.0%之间，相对标准偏差均小于10%。表明该方法可用于OTA的定量检测。

3 结论

近年来，食品安全问题引起了全世界的普遍关注，尤其是毒素污染问题[12]。OTA在自然界中分布广泛，是目前花生等油料作物污染较严重并且毒性最强的天然污染物之一。我国规定食品中赭曲霉毒素的含量（GB 2761-2011食品中真菌毒素限量）：谷物、豆类及其制品小于5.0 μg/kg；欧盟规定胡椒中的OTA残留限量为15 μg/kg，辣椒中为30 μg/kg，小麦蛋白中为8.0 μg/kg。

本研究利用多克隆抗体的强富集能力以及生物素-亲和素系统的放大作用，以量子点标记的链霉亲和素为荧光探针，建立了一种灵敏度高、特异性强的基于量子点技术的OTA sFLISA方法，在3.125～125 μg/L范围内具有良好的线性关系，加标回收试验结果较好，回收率范围在90.1%～110.0%之间，变异系数均小于10%，能够满足我国和欧盟有关食品中OTA检测限量要求，该方法具有分析时间短、不需要酶和显色液、荧光性能稳定等优点，可为OTA在食品安全等应用领域提供技术基础和参考依据。

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