一种简易观察管花肉苁蓉寄生过程的方法

张金霞　王华磊　郭玉海　翟志席

摘要：木箱-玻璃板法可以在不伤害肉苁蓉种子和柽柳根系的情况下，直观地观察到管花肉苁蓉寄生的整个过程，建立一种可视的管花肉苁蓉寄生的观察方法，为进一步明确管花肉苁蓉寄生过程和寄生机理提供一种研究模型。

关键词：管花肉苁蓉；木箱-玻璃法；柽柳；寄生过程；寄生机理

中图分类号： Q944.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0211-02

收稿日期：2013-06-04

基金项目：科技部农业科技成果转化资金（编号：2011GB23600014）；贵州省科技计划[编号：黔科合院所创能（2010）4002]。

作者简介：张金霞（1978—），女，河北邢台人，硕士，助理研究员，从事中草药栽培研究。E-mail：jx9801@126.com。

通信作者：郭玉海，教授，博士生导师，从事中草药栽培研究。E-mail：yhguo@cau.edu.cn。管花肉苁蓉[Cistanche tubulosa （Schenk）R.Wight]为列当科的寄生植物，性甘、咸、温，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效[1]。管花肉苁蓉具有根寄生特性，其寄生过程在土壤中进行，因此难以观察它的生长过程。目前，国内外的研究多侧重于利用列当愈伤组织离体侵染寄主体系的建立[2-3]，研究多集中于列当属植物侵染草本植物，由于管花肉苁蓉的寄主柽柳是木本植物，侵染较困难，所以关于这方面的研究相对较少，其寄生关系也有待于进一步深入研究。李天然等采用盆栽法收集了与梭梭根接种的、处于不同时期的种子萌发体[4]，最早研究了肉苁蓉种子的萌发与寄主梭梭的关系。王华磊通过田间连续大量取样，观察了管花肉苁蓉种子萌发、寄生于柽柳根、长出幼苗寄生过程的形态学变化[5]。马东明采用无菌培养法建立了柽柳刺激管花肉苁蓉种子萌发的技术[6]，在无菌状态下研究管花肉苁蓉接种柽柳的过程，由于培养基和土壤环境存在较大差异，因此采取田间采样观察管花肉苁蓉萌发和寄生过程，对接种的管花肉苁蓉进行不定期采挖。由于采挖过程容易对管花肉苁蓉和柽柳根系造成伤害，且仅限于用肉眼观察，另外，管花肉苁蓉种子非常小，采挖和观察比较困难，所以管花肉苁蓉寄生及生长所需适宜生态条件尚未研究清楚，难以对田间栽培进行科学指导。生产中主要存在种源浪费严重、接种率低、接种周期长等问题，本研究针对这些问题，建立了一种可视化观察管花肉苁蓉接种试验体系，突破了肉眼的限制，借助体视显微镜进行观察，在不伤害管花肉苁蓉生长的情况下观察管花肉苁蓉的寄生过程。

1材料与方法

1.1供试材料

管花肉苁蓉种子来源于新疆于田种植场。

1.2仪器

奥林巴斯 SZH-10型体视显微镜；20 cm×20 cm的木板2块；20 cm×15 cm的木板3块；有机透明玻璃板；白纱布。

1.3方法

1.3.1柽柳实生苗的培养取成熟的柽柳种子，将其均匀撒播在装有湿润沙土的花盆中，在花盆口覆盖1层透明的塑料膜，在光照强度为1 600 lx、温度为25 ℃下培养，待柽柳长出沙土2～3 cm将塑料膜揭去，待柽柳长至15～20 cm时备用。

1.3.2管花肉苁蓉种子的前处理方法经过初步分级的05～0.8 mm管花肉苁蓉种子放置于2～5 ℃下低温层积6个月，完成生理后熟。

1.3.3木箱-玻璃板法将木箱订成簸箕状，其中3个侧面为长方形木板（20 cm×15 cm），2个正方形宽面（20 cm×20 cm ）中的一面安装木板，另一面安装可以开启的玻璃门，将木箱开口和装玻璃的一面斜向上放置，填入湿沙土至木箱的窄木板一半厚度，取株高达15～20 cm的柽柳实生苗2棵，剪掉一部分枝干，将柽柳根平铺在湿沙中，此时柽柳放置方向与玻璃板保持一致。然后继续用湿沙覆盖住柽柳根部，将沙土表面压实压平整，在湿沙上铺2层白纱布，以便柽柳根能穿过纱布生长，将透明玻璃板压紧在纱布上。用黑布将玻璃板完全包裹起来，玻璃板朝向背光的一面，将箱体与水平夹角呈60° 倾斜向阳放置，这样既能保证柽柳枝叶进行光合作用，又能保证柽柳根部受重力作用垂直长出纱布，待柽柳根约穿透纱布面积的 1/2 时，将经过6个月层积的管花肉苁蓉种子放在柽柳根周围的0～5 cm处，每棵柽柳根上放置60粒，置于光照强度为 1 600 lx、温度为（25±2） ℃的条件下培养，10棵柽柳为1个处理，每个处理重复3次。定期用奥林巴斯 SZH-10型体视显微镜观察种子萌发和接种于寄主根的情况，记录并拍照。

2结果与分析

2.1管花肉苁蓉种子的萌发

采用木箱-玻璃板法，用湿沙土作介质，将层积6个月的管花肉苁蓉种子播种到柽柳根附近0～5 mm范围内，20 d左右开始萌发。李天然等发现，肉苁蓉种子在钻入种皮内的寄主根的诱发下萌发，其种胚细胞伸长形成管状突起[4]。本试验还发现管花肉苁蓉有另外一种萌发方式，即在未触及管花肉苁蓉种子时，柽柳根附近的管花肉苁蓉种子就开始萌发，且越靠近柽柳根区0～5 mm范围内的管花肉苁蓉种子萌发越多，管花肉苁蓉的芽管状器官比较粗壮，说明柽柳的新生毛细根尖会释放出某种化学物质，刺激管花肉苁蓉种子种胚细胞分裂，进而促进其萌发。随后芽管状器官逐渐发育出具乳头状突起的初生吸器，膨大的初生吸器表皮有许多褶皱，其前端呈现出淡黄色或乳白色透明状，芽管状器官发育出乳突状物。管花肉苁蓉的萌发过程经历了由初生吸器逐渐发育出次生吸器阶段，吸器的发生是寄主植物能否建立寄生关系的关键。

2.2管花肉苁蓉入侵柽柳根的形态变化

管花肉苁蓉种子从萌发到侵入柽柳根木质部约需10 d，在体视显微镜下观察，发现管花肉苁蓉膨大的乳头状突起（图1）头部出现了淡黄色的分泌物，此现象在小列当和大麻列当愈伤组织上曾经报道过[7]。但其化学成分有待于进一步鉴定，初步推测为一些水解酶类物质，能促使柽柳根细胞壁溶解，以便于管花肉苁蓉侵入寄主根部。多数管花肉苁蓉种子芽管状器官一旦接触到寄主根，芽管状器官即停止伸长，其头部形成膨大的具乳突状物器官，芽管状器官端分泌一些酶类物质侵入寄主皮层。一旦管花肉苁蓉吸器的导管和柽柳根系的导管相连接（图2），管花肉苁蓉就可以从寄主木质部摄取水分和无机盐，满足自身生长需求。

2.3管花肉苁蓉寄生柽柳根部形态解剖结构

在显微镜下对管花肉苁蓉、柽柳接合处的石蜡切片进行观察（图3），结果显示，管花肉苁蓉茎的结构为草本双子叶植物茎结构，由表皮、皮层、维管组织组成。管花肉苁蓉的吸器均由大量长方形薄壁细胞和螺纹导管组成。吸器与寄主柽柳木质部接触处为多数体积小、细胞质浓的薄壁细胞和螺纹导管，细胞核小而多，吸器的导管与柽柳根的导管相连接，由这些细胞从寄主木质部摄取水分和无机盐，再由吸器薄壁组织转运到吸器导管输送到茎和叶，形成一个输送水溶液的通道。

3小结

关于管花肉苁蓉种子萌发与寄生生理方面的研究还很薄弱，很多问题尚待研究。采用木箱-玻璃板法研究管花肉苁蓉与柽柳的接种过程，能明确管花肉苁蓉种子从萌发到寄生的整个生长阶段，对每个生长阶段的管花肉苁蓉和柽柳进行形态学和解剖学观察，以明确管花肉苁蓉吸器的生长发育、寄生时间、寄生距离和寄生的主动性等问题，从而提高肉苁蓉田间接种率和接种同步性，避免了只有通过人工采挖才能确定管花肉苁蓉寄生过程的盲目性。该方法操作简单，在室内即可进行，条件可控，适用于工厂化生产管花肉苁蓉-柽柳复合苗，对管花肉苁蓉高效接种技术的形成具有重要意义，对进一步探索寄生植物寄生过程与寄生机理具有一定的理论和实践价值。

参考文献：

[1]国家药典委员会. 中国药典：一部[S]. 北京：中国医药科技出版社，2010.

[2]Baird W V，Riopel J L. Experimental studies of the attanchment of the parasitic angiosperm Agalinis purpurea to a host[J]. Protoplasma，1983，118：206.

[3]Lane J A，Bailey J A，Terry P J. In-vitro growth system for studying the parasitism of cowpea（Vigna unguiculata）by striga gesnerioides[J]. Weed Research，1991，31（4）：211-217.

[4]李天然，许月英，戈建新，等. 肉苁蓉（Cistanche deserticola Ma）种子的萌发及与寄主梭梭（Halaxylon ammodenron Bunge）的关系[J]. 内蒙古大学学报：自然科学版，1989，20（3）：395-400.

[5]王华磊，杨太新，杨重军，等. 管花肉苁蓉种子萌发和寄生过程的形态学研究[J]. 中国中药杂志，2005，30（23）：1812-1814.

[6]马东明，杨太新，陈庆亮，等. 管花肉苁蓉与柽柳试管苗离体接种的研究[J]. 植物学通报，2005，22（6）：687-691.

[7]Zhou W J，Yoneyama K，Takeuchi Y，et al. In vitro infection of host roots by differentiated calli of the parasitic plant Orobanche[J]. Journal of Experimental Botany，2004，55（398）：899-907.成明超，李丹霞，王康才，等. 5个药用菊花品种类型主要化学成分的动态累积[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：213-215.