红缘拟层孔菌的培养条件

孙勇　蒋继宏

摘要：为了解药用真菌红缘拟层孔菌的最佳培养条件，在单因素试验的基础上，以葡萄糖、蛋白胨、黄豆粉煮汁、pH值为因素，以菌丝干质量和发酵液抗肿瘤活性为标准，采用正交试验方法从中选出最优培养条件。结果表明：红缘拟层孔菌生长的最适温度为25 ℃，中性偏酸性环境，最适碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨，以菌丝干质量为标准，最优培养条件为：葡萄糖25 g/L，蛋白胨10 g/L，黄豆粉煮汁3 g/L，pH值为6；以发酵液抗肿瘤活性为标准，最佳培养条件为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨8 g/L，黄豆粉煮汁4 g/L，pH值为6。

关键词：红缘拟层孔菌；菌丝干质量；抗肿瘤活性

中图分类号：Q93-335文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0208-03

收稿日期：2013-05-20

基金项目：江苏省徐州师范大学基金项目（编号：10XLA20）。

作者简介：孙勇（1977—），男，江西高安人，硕士，讲师，从事微生物学研究。 E-mail：sunyong23@jsnu.edu.cn。

通信作者：蒋继宏，博士，教授。Tel：（0516）83403515；E-mail：jhjiang@xznu.edu.cn。红缘拟层孔菌[Fomitopsis pinicola （Swartz.：Fr.）Karst.]分类上属于多孔菌目多孔菌科拟层孔菌属，是一种对云杉等针叶树危害较大的木腐菌，引起木材木质部褐色块状腐朽，对小白鼠肉瘤180及艾氏肉瘤抑制率分别为70%和80%[1]。近来的研究结果表明，红缘拟层孔菌水提取物能降低血糖浓度，升高血液中HDL浓度，降低LDL浓度[2]；红缘拟层孔菌多糖能够抑制VEGF诱导的血管生成，乙醇提取物能够抑制IFN-γ诱导的炎症标记物IP-10的生成，但对脉管内皮细胞没有细胞毒性作用[3]；红缘拟层孔菌提取物能够清除DPPH自由基、超氧化物阴离子自由基；对SK-Hep3B、HeLa、HO-1、PLC/RF/5、Hep3B、SNU354、SNU185等肿瘤细胞均有细胞毒性作用（醇提物活性比水提物活性强）[4]；红缘拟层孔菌的石油醚相、乙酸乙酯相和甲醇相提取物对HeLa细胞的IC50分别为71.04、36.43、198.04 μg/mL，对SMMC-7721的IC50分别为45.22、35.63、187.56 μg/mL[5]；Yoshikawa等发现红缘拟层孔菌有3种三萜类化合物具有选择性抑制COX-2的作用[6]；Isabelle 等研究了红缘拟层孔菌的抗木霉菌活性[7]。综上所述，红缘拟层孔菌具有消炎、抗氧化、抗肿瘤等作用，是一种具有开发前景的药用真菌。我们从黑龙江省长白山上采集到野生子实体，对其进行分离驯化研究，研究温度、酸碱度和营养条件对该菌株生长的影响，为了解该菌的培养特性和进一步研究开发做准备。

1材料与方法

1.1供试菌种和肿瘤细胞

供试菌种：红缘拟层孔菌菌种，由江苏省药用植物生物技术重点实验室提供，分离自东北长白山红缘拟层孔菌子实体。

胃腺癌肿瘤细胞：SGC-7901。

1.2温度对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响

将分离得到的红缘拟层孔菌菌种用PDA平板在26 ℃条件下连续培养6 d，使其形成可供试验的菌落，用无菌的打孔器取直径5 mm的菌落块，置于PDA平板中，每皿放3块，呈等边三角形放置，分别置于10、15、20、25、30、35、40 ℃的恒温培养箱中，连续培养6 d，用“十”字交叉法测量菌落直径，并观察菌落形态、菌丝长势。菌丝长势浓密健壮用“+++”表示，生长较浓密用“++”表示，生长较稀疏用“+”表示，生长稀疏用空白表示，不生长用“-”表示。

1.3pH值对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响

用1 mol/L氢氧化钠和1 mol/L 盐酸将PDA培养基的pH值调节为5、6、7、8、9、10、11共7个梯度。将不同pH值的培养基倒入直径为 90 mm 的培养皿中，制成固体平板，置于26 ℃恒温箱中连续培养6 d。用“十”字交叉法测量菌落直径，观察记载菌丝生长势。生长势表示方法同上。

1.4红缘拟层孔菌对碳源和氮源的利用

供试碳源：淀粉、糊精、羧甲基纤维素钠、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇。

供试氮源：氯化氨、硝酸钾、黄豆粉、酵母粉、蛋白胨、尿素。

碳源利用试验的基础培养基为：0.32 g硝酸铵，1 g 磷酸二氢钾，0.5 g MgSO4·7H2O，0.005 g/L 维生素B1，琼脂 20 g，蒸馏水1 000 mL。以2%的量加入不同的碳源，自然pH值，在每一平板中接入直径5 mm的菌落3块，呈等边三角形排列，置于26 ℃恒温培养箱中，连续培养6 d，“十”字交叉法测量菌落直径，并观察菌落形态、菌丝长势。

氮源利用试验的基础培养基为：20 g葡萄糖，1 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.005 g 维生素B1，20 g琼脂，蒸馏水1 000 mL，以10 g/L的量加入5种不同的氮源，自然pH值，其他方法同碳源试验。以氮源基础培养基为空白对照。

1.5正交试验设计

从碳氮源试验结果中选出最好的碳源和氮源作为正交试验因素，结合pH值因素，采用正交设计进行最佳培养条件试验。采用150 mL三角瓶培养（装液量50 mL），每处理重复3次。

1.6MTT法测定红缘拟层孔菌抗肿瘤活性

人胃腺癌肿瘤细胞SGC-7901以8×104个/孔的浓度接种于96孔培养板中，在5%CO2 37 ℃培养箱中培养24 h后，加入提取物浓度为100 μg/mL，继续培养48 h，弃去溶液，用200 μL基本培养基洗1次，每孔加入50 μL 37 ℃预热的MTT（2 mg/mL）4 h，弃去培养基，用PBS洗一次，每孔加200 μL DMSO，在平板摇床上摇30 min，在酶标仪570 nm下读板，根据测得的吸光度计算抑制率。

抑制率=（1-试验组吸光度/对照组吸光度）×100%

2结果与分析

2.1温度对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响

由表1可知：红缘拟层孔菌生长最快的温度为30 ℃，培养6 d的菌落直径达7.5 cm，红缘拟层孔菌低于10 ℃和高于40 ℃时均不生长，25 ℃生长速度慢， 但菌丝的生长势明显高

表1不同温度下红缘拟层孔菌的菌落

温度（℃）1菌落直径（cm）1生长势1010Aa1-1511.983 3±0.147 20Cc1++2013.433 3±0.103 28Dd1+++2514.933 3±0.975 02Ee1+++3017.550 0±0.441 59Ff1++3511.183 3±0.147 20Bb1+4010Aa1-注：培养时间为6 d。同列数值后不同大、小写字母分别表示差异达0.01和0.05显著水平。

于30 ℃时的生长势，说明红缘拟层孔菌为中温型菌类。

2.2pH值对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响

红缘拟层孔菌在pH值7左右生长最好，培养基pH值 5～8 时菌丝生长无显著差异，当pH达到9以上时生长速度明显变慢，生长势变差（表2）。由此可见，红缘拟层孔菌喜欢中性偏酸性环境。

3讨论

本试验结果表明，菌丝产量和发酵液抗肿瘤活性并不同步，产量最高的培养条件下，发酵液抗肿瘤活性不一定高，在供试水平内，营养成分越高，产量越高，但抗肿瘤活性水平不高，可能是营养丰富的条件下，菌丝处于快速生长期，代谢产物还没有积累，培养时间加长可能更有利于活性成分的积累。

MTT法测定抗肿瘤活性时，发酵液的酸碱度对肿瘤细胞的生长有一定的影响，试验时发酵液pH值应调节至7左右才能排除发酵液偏酸的影响，另外，本试验发酵液的测定是在稀释10倍的条件下测定的，因而，基本可以排除pH值对肿瘤细胞的影响。

参考文献：

[1]卯晓岚. 中国大型真菌[M]. 郑州：河南科学技术出版社，2000：465.

[2]Wol-Suk C，Ding J L，Hyun-Jae S，et al. Effect of fomitopsis pinicola extract on blood glucose and lipid metabolism in diabetic rats[J]. Korean Journal of Chemical Engineering，2009，26（6）：1696-1699.

[3]Cheng J J，Lin C Y，Lur H S，et al. Properties and biological functions of polysaccharides and ethanolic extracts isolated from medicinal fungus，Fomitopsis pinicola[J]. Process Biochemistry，2008，43：829-834.

[4]Choi D，Sang-Shin P，Ding J L，et al. Effects of fomitopsis pinicola extract on antioxydant and antitumor activities[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2007，12：516-524.

[5]Ren G，Liu X Y，Zhu H K，et al. Evaluation of cytotoxic activities of some medicinal polypore fungi from China[J]. Fitoterapia，2006，77（5）：408-410.

[6]Yoshikawa K，Inoue M，Matsumoto Y，et al. Lanostane triterpenoids and triterpene glycosides from the fruit body of Fomitopsis pinicola and their inhibitory activity against COX-1 and COX-2[J]. Journal of Natural Products，2005，68（1）：69-73.

[7]Isabelle S G，Daniel J，Hmamda A. Selection of grifola frondosa and fomitopsis pinicola strains resistant to trichoderma viride in Teflon tubes confrontation method[J]. Mycological Progress，2004，3（4）：329-336.张金霞，王华磊，郭玉海，等. 一种简易观察管花肉苁蓉寄生过程的方法[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：211-212.

抑制率=（1-试验组吸光度/对照组吸光度）×100%

2结果与分析

2.1温度对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响

由表1可知：红缘拟层孔菌生长最快的温度为30 ℃，培养6 d的菌落直径达7.5 cm，红缘拟层孔菌低于10 ℃和高于40 ℃时均不生长，25 ℃生长速度慢， 但菌丝的生长势明显高

表1不同温度下红缘拟层孔菌的菌落

温度（℃）1菌落直径（cm）1生长势1010Aa1-1511.983 3±0.147 20Cc1++2013.433 3±0.103 28Dd1+++2514.933 3±0.975 02Ee1+++3017.550 0±0.441 59Ff1++3511.183 3±0.147 20Bb1+4010Aa1-注：培养时间为6 d。同列数值后不同大、小写字母分别表示差异达0.01和0.05显著水平。

于30 ℃时的生长势，说明红缘拟层孔菌为中温型菌类。

2.2pH值对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响

红缘拟层孔菌在pH值7左右生长最好，培养基pH值 5～8 时菌丝生长无显著差异，当pH达到9以上时生长速度明显变慢，生长势变差（表2）。由此可见，红缘拟层孔菌喜欢中性偏酸性环境。

3讨论

本试验结果表明，菌丝产量和发酵液抗肿瘤活性并不同步，产量最高的培养条件下，发酵液抗肿瘤活性不一定高，在供试水平内，营养成分越高，产量越高，但抗肿瘤活性水平不高，可能是营养丰富的条件下，菌丝处于快速生长期，代谢产物还没有积累，培养时间加长可能更有利于活性成分的积累。

MTT法测定抗肿瘤活性时，发酵液的酸碱度对肿瘤细胞的生长有一定的影响，试验时发酵液pH值应调节至7左右才能排除发酵液偏酸的影响，另外，本试验发酵液的测定是在稀释10倍的条件下测定的，因而，基本可以排除pH值对肿瘤细胞的影响。

参考文献：

[1]卯晓岚. 中国大型真菌[M]. 郑州：河南科学技术出版社，2000：465.

[2]Wol-Suk C，Ding J L，Hyun-Jae S，et al. Effect of fomitopsis pinicola extract on blood glucose and lipid metabolism in diabetic rats[J]. Korean Journal of Chemical Engineering，2009，26（6）：1696-1699.

[3]Cheng J J，Lin C Y，Lur H S，et al. Properties and biological functions of polysaccharides and ethanolic extracts isolated from medicinal fungus，Fomitopsis pinicola[J]. Process Biochemistry，2008，43：829-834.

[4]Choi D，Sang-Shin P，Ding J L，et al. Effects of fomitopsis pinicola extract on antioxydant and antitumor activities[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2007，12：516-524.

[5]Ren G，Liu X Y，Zhu H K，et al. Evaluation of cytotoxic activities of some medicinal polypore fungi from China[J]. Fitoterapia，2006，77（5）：408-410.

[6]Yoshikawa K，Inoue M，Matsumoto Y，et al. Lanostane triterpenoids and triterpene glycosides from the fruit body of Fomitopsis pinicola and their inhibitory activity against COX-1 and COX-2[J]. Journal of Natural Products，2005，68（1）：69-73.

[7]Isabelle S G，Daniel J，Hmamda A. Selection of grifola frondosa and fomitopsis pinicola strains resistant to trichoderma viride in Teflon tubes confrontation method[J]. Mycological Progress，2004，3（4）：329-336.张金霞，王华磊，郭玉海，等. 一种简易观察管花肉苁蓉寄生过程的方法[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：211-212.

抑制率=（1-试验组吸光度/对照组吸光度）×100%

2结果与分析

2.1温度对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响

由表1可知：红缘拟层孔菌生长最快的温度为30 ℃，培养6 d的菌落直径达7.5 cm，红缘拟层孔菌低于10 ℃和高于40 ℃时均不生长，25 ℃生长速度慢， 但菌丝的生长势明显高

表1不同温度下红缘拟层孔菌的菌落

温度（℃）1菌落直径（cm）1生长势1010Aa1-1511.983 3±0.147 20Cc1++2013.433 3±0.103 28Dd1+++2514.933 3±0.975 02Ee1+++3017.550 0±0.441 59Ff1++3511.183 3±0.147 20Bb1+4010Aa1-注：培养时间为6 d。同列数值后不同大、小写字母分别表示差异达0.01和0.05显著水平。

于30 ℃时的生长势，说明红缘拟层孔菌为中温型菌类。

2.2pH值对红缘拟层孔菌菌丝生长的影响

红缘拟层孔菌在pH值7左右生长最好，培养基pH值 5～8 时菌丝生长无显著差异，当pH达到9以上时生长速度明显变慢，生长势变差（表2）。由此可见，红缘拟层孔菌喜欢中性偏酸性环境。

3讨论

本试验结果表明，菌丝产量和发酵液抗肿瘤活性并不同步，产量最高的培养条件下，发酵液抗肿瘤活性不一定高，在供试水平内，营养成分越高，产量越高，但抗肿瘤活性水平不高，可能是营养丰富的条件下，菌丝处于快速生长期，代谢产物还没有积累，培养时间加长可能更有利于活性成分的积累。

MTT法测定抗肿瘤活性时，发酵液的酸碱度对肿瘤细胞的生长有一定的影响，试验时发酵液pH值应调节至7左右才能排除发酵液偏酸的影响，另外，本试验发酵液的测定是在稀释10倍的条件下测定的，因而，基本可以排除pH值对肿瘤细胞的影响。

参考文献：

[1]卯晓岚. 中国大型真菌[M]. 郑州：河南科学技术出版社，2000：465.

[2]Wol-Suk C，Ding J L，Hyun-Jae S，et al. Effect of fomitopsis pinicola extract on blood glucose and lipid metabolism in diabetic rats[J]. Korean Journal of Chemical Engineering，2009，26（6）：1696-1699.

[3]Cheng J J，Lin C Y，Lur H S，et al. Properties and biological functions of polysaccharides and ethanolic extracts isolated from medicinal fungus，Fomitopsis pinicola[J]. Process Biochemistry，2008，43：829-834.

[4]Choi D，Sang-Shin P，Ding J L，et al. Effects of fomitopsis pinicola extract on antioxydant and antitumor activities[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2007，12：516-524.

[5]Ren G，Liu X Y，Zhu H K，et al. Evaluation of cytotoxic activities of some medicinal polypore fungi from China[J]. Fitoterapia，2006，77（5）：408-410.

[6]Yoshikawa K，Inoue M，Matsumoto Y，et al. Lanostane triterpenoids and triterpene glycosides from the fruit body of Fomitopsis pinicola and their inhibitory activity against COX-1 and COX-2[J]. Journal of Natural Products，2005，68（1）：69-73.

[7]Isabelle S G，Daniel J，Hmamda A. Selection of grifola frondosa and fomitopsis pinicola strains resistant to trichoderma viride in Teflon tubes confrontation method[J]. Mycological Progress，2004，3（4）：329-336.张金霞，王华磊，郭玉海，等. 一种简易观察管花肉苁蓉寄生过程的方法[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：211-212.