5—氨基乙酰丙酸对油菜幼苗抗冷性和抗氧化系统的影响

2014-07-18张治平张丽丽

江苏农业科学 2014年2期

张治平+张丽丽

摘要：以油菜品种沪油15为材料，叶面喷施30 mg/L 5-氨基乙酰丙酸（ALA）4 d，再置于4 ℃低温条件下处理 8 d，分析测定了低温处理0、4、8 d及恢复 4 d后光合色素含量及SOD、CAT、APX、POD等抗氧化酶活性、脯氨酸含量、超氧阴离子（ O-2· ）生成速率及MDA含量等生理指标，研究了ALA对油菜幼苗抗冷性的影响及作用机制。结果表明，低温胁迫下，喷施ALA明显缓解了油菜叶片叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl a）和总叶绿素（Chl）含量的下降程度，增加了类胡萝卜素（Car）的含量，显著提高了SOD、CAT、APX和POD的活性和脯氨酸的含量，降低了O-2· 生成速率和MDA含量的上升幅度。低温胁迫时间越长，ALA的作用效果越明显，说明喷施ALA通过促进叶绿素的合成，提高油菜植株的抗氧化能力，降低活性氧的产生，减少膜脂过氧化的伤害程度，从而提高了油菜幼苗的抗冷性。另外，喷施ALA可以促进油菜幼苗在受到低温伤害后迅速恢复。

关键词：油菜；低温胁迫；5-氨基乙酰丙酸；叶绿素；类胡萝卜素；抗氧化酶；脯氨酸

中图分类号： S634.301文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0052-03

收稿日期：2013-07-23

基金项目：国家自然科学青年基金（编号：31101505）。

作者简介：张治平（1982—），女，河南洛阳人，博士，主要从事蔬菜逆境生理和分子生物学研究。E-mail：zhangzp0422@163.com。油菜（Brassica napus L.）作为一种重要的油料作物，种植极为广泛，遍及世界各地，我国油菜种植面积和产量均居世界第一位[1]。油菜是越冬作物，低温已经成为影响其正常生长的主要限制因子，冬春季持续低温冻害极易引起油菜叶片变黄、干枯、花蕾脱落、开花而不结实，一些严重冻害甚至可能造成整株死亡，导致油菜绝收，给油菜生产造成严重损失[1-2]。因此，提高油菜的耐低温能力越来越为人们所关注。

5-氨基乙酰丙酸（ALA）是所有生物体内卟啉化合成的关键前体[3]，低浓度时，ALA能够促进叶绿素（Chl）合成，调节植物生长发育，提高多种植物的抗冷性[4-7]。据报道，ALA显著提高西瓜植株生长量，增强植株抵抗低温弱光的能力[4]。沈奇等研究表明，ALA可以促进辣椒Chl的合成，增强光合作用，提高渗透调节物质含量和提高SOD、CAT和POD活性，维持膜系统的稳定性，从而缓解低温胁迫对辣椒的伤害[5]。但是，喷施ALA提高油菜幼苗耐低温能力的研究尚鲜有报道。为此，本研究以油菜为试验材料，分析在4 ℃低温胁迫下，喷施ALA对油菜叶片Chl和类胡萝卜素（Car）含量、抗氧化酶活性、游离态脯氨酸含量、 O-2· 生成速率和MDA含量的影响，研究ALA提高油菜幼苗抗冷性的原因，以期为油菜生产提供技术支持。

1材料与方法

1.1供试材料与培养

本试验以油菜品种沪油 15为材料。挑选饱满的种子，用70%乙醇浸泡1 min，25%次氯酸钠消毒10 min，蒸馏水冲洗3次。37 ℃暗培养出芽后，播种于营养钵中。营养土配制为蛭石 ∶黑土 ∶珍珠岩=18 ∶6 ∶1；培养条件设定昼/夜温度为（25±1） ℃/（15±1） ℃，光周期为16 h/8 h（昼/夜），光强为 300 μmol/（m2·s）。育苗期间正常管理，按照需要施肥和浇水。

1.2试验处理

油菜幼苗培养至5叶1心期，选取生长一致的植株，用30 mg/L的ALA溶液喷施，并设清水对照。喷施时溶液中添加 0.01% Triton，均匀地喷洒叶片的正反面，以叶片滴水为喷施标准。ALA处理后4 d，放入人工气候箱中进行低温处理，温度为4 ℃，光照条件和培养期间相同。低温处理 8 d，之后转移至昼/夜（25±1） ℃/（15±1） ℃温度条件下，恢复 4 d。低温处理0 d、4 d、8 d及恢复 4 d时分别取完全展开的第4、第5片真叶测定有关生理指标。

1.3试验方法

1.3.1叶片光合色素含量的测定采用乙醇浸提法提取并测定油菜叶片Chl和Car的含量[8]。

1.3.2抗氧化酶活性测定SOD 活性测定采用氮蓝四唑（NBT）光还原法[9]，以抑制反应50%为1个酶活力单位（U）；CAT活性测定采用紫外吸收法，以1 min D240 nm值减少0.01为1个酶活力单位（U）[10]；APX 活性测定参照Nakano等的方法[11]；POD 活性测定采用愈创木酚法[12]。

1.3.3 O-2· 生成速率和MDA含量测定O-2·生成速率测定采用α-萘胺法[13]；MDA含量的测定用硫代巴比妥酸（TBA）法[14]。

1.3.4游离态脯氨酸含量测定脯氨酸含量测定采用磺基水杨酸提取法[15]。

1.3.5统计分析采用Excel 2011和SAS软件对数据进行统计分析和差异显著性检验。

2结果与分析

2.1ALA对低温胁迫下油菜幼苗光合色素含量的影响

此外，常温条件下，喷施ALA对油菜叶片Car含量没有显著影响。低温胁迫4 d，对照叶片Car含量增加，但没有达到明显差异；同对照相比，ALA预处理显著增加了Car含量，Car含量提高了14.4%。经过低温胁迫8 d，对照Car含量下降，但是ALA处理的Car含量仍然保持较高的水平。恢复后，对照Car含量的恢复到低温处理前的81.7%；喷施ALA的Car含量恢复到低温胁迫前水平（表1）。

2.1ALA对低温胁迫下油菜抗氧化酶活性和脯氨酸含量的影响

常温下，喷施ALA显著增加了油菜叶片SOD、APX和POD的活性，而CAT的活性和脯氨酸的含量增加不明显。经过4 ℃低温处理，油菜叶片的SOD、APX、CAT、POD的活性和脯氨酸含量明显增加，并且这种增加量随着低温胁迫时间的延长而升高；喷施ALA显著增加了的油菜叶片SOD、APX、CAT、POD的活性和脯氨酸含量，低温胁迫8 d时，ALA处理的 SOD、APX、CAT、POD的活性和脯氨酸含量最高。另外，与对照相比，低温胁迫4 d时，ALA处理的SOD、CAT的活性和脯氨酸含量增加量最多，分别增加了22.6%、23.1%和184%，而APX和POD的活性则是在低温胁迫8 d时提高得最多，分别提高了51.4%和30.9%。常温恢复4 d，油菜叶片的SOD、APX、CAT和POD的活性下降到低温处理前水平，喷施ALA的叶片SOD、APX、CAT和POD的活性仍然高于对照；但是脯氨酸含量保持较高的水平，各处理之间没有明显差异（表2）。

2.4ALA对低温胁迫下油菜 O-2· 生成速率和MDA含量的影响

常温条件下，喷施ALA对 O-2· 生成速率和MDA含量没有明显影响。低温胁迫下，对照的 O-2· 生成速率和MDA含量升高，低温胁迫4 d对照叶片 O-2· 生成速率和MDA含量分别上升了74.3%和55.3%；低温胁迫8 d，则达到低温处理前的2.85倍和2.56倍。ALA预处理能减轻油菜叶片 O-2· 生成速率和MDA含量的升高程度，低温处理8 d时，表现得最明显，同对照相比，喷施ALA的 O-2· 生成速率和MDA含量分别下降了32.3%和30.1%。经过4 d恢复， O-2· 生成速率和MDA含量开始下降，但只有喷施ALA的油菜叶片 O-2· 生成速率和MDA含量下降到低温处理前水平（表3）。

3讨论

低温条件下植物体内产生大量的活性氧和自由基，可以引起叶绿素的破坏和分解[16-17]。研究表明，外源ALA可以

增加叶片Chl含量，提高植株的抗冷性[5-6]。另外，用含有ALA的肥料喷施芸豆，2个月后，Chl含量仍然明显高于对照[18]。本研究中，喷施ALA显著提高了油菜叶片Chl a、Chl b 和Chl 的含量，这种增加效应随着低温胁迫持续时间的延长表现得更加显著。经过常温恢复后，ALA处理的油菜叶片Chl a、Chl b和Chl迅速恢复，说明ALA可以促进油菜叶片Chl的合成，并且ALA的这种效应具有长效性，一直持续存在于整个低温胁迫和恢复过程中。

植物在正常代谢过程中和逆境胁迫下均能产生活性氧。正常情况下，植物体内产生的活性氧可以及时地被清除掉，不会对细胞产生伤害，但植物受到胁迫后，活性氧大量积累，导致膜脂过氧化的产生[5，16-17]。本研究中常温条件下 O-2· 的生成速率和MDA含量比较低，喷施ALA对 O-2· 的生成速率和MDA含量的影响不明显，说明常温下，油菜细胞内自由基含量以及细胞膜脂损伤程度没有显著变化。油菜遭受低温胁迫后，活性氧大量产生， O-2· 的生成速率和MDA含量迅速升高，胁迫时间越久， O-2· 的生成速率和MDA含量增加量越多。喷施ALA显著降低了 O-2· 的生成速率和MDA含量，低温胁迫8 d，ALA的作用效果最明显，表明低温胁迫打破了油菜细胞中活性氧产生和清除的动态平衡，使 O-2· 的生成速率迅速增加，并引起细胞膜氧化损伤，低温持续时间越长，细胞膜损伤越严重。喷施ALA降低了油菜 O-2· 的生成速率，缓解了膜脂过氧化的产生程度。沈奇等研究表明，低温胁迫下，ALA处理辣椒幼苗 O-2· 的生成速率和MDA含量均呈先急剧上升又下降的趋势[5]；刘卫琴等等认为正常生长条件下ALA显著降低了草莓叶片的MDA含量[19]；而康琅等发现ALA对低温胁迫下西瓜幼苗的MDA含量没有影响[4]。这些结果表明，ALA对氧化胁迫调节具有复杂性，ALA处理降低了 O-2· 的生成速率，但对MDA的影响需要进一步研究。

植物在遭受低温胁迫后，活性氧大量积累，植物会诱导一系列抗氧化保护酶活性迅速提高来清除过多的活性氧，缓解低温对其造成的伤害。SOD、CAT、APX和 POD是细胞内清除活性氧的主要酶促保护系统。SOD可以催化 O-2· 生成H2O2，产生的 H2O2又可由 CAT、APX和POD进一步分解形成 H2O和O2，它们共同防御活性氧对细胞的伤害[16]。ALA是血红素合成的前体，外源ALA可以增加亚铁血红素的含量。而CAT、POD和APX同属于亚铁血红素蛋白酶类。本研究中喷施ALA显著提高SOD、CAT、APX和POD活性与含量，这与前人在西瓜、辣椒、西葫芦和黄瓜等上的研究结果[4-7]是一致的。由此说明 ALA提高抗氧化酶活性，增加植株的抗氧化能力，在增强植物抗冷性中发挥着重要的作用。

此外，植物体内还存在一些如Car和脯氨酸等非酶促抗氧化保护物质，用来抵御逆境胁迫对细胞造成的伤害。Car存在于叶绿体内，在所有的单线态氧（1O2）猝灭系统中，具有最重要的意义。正常状态下，植物体内脯氨酸含量很低，但受到逆境胁迫时，脯氨酸就会大量积累，改善细胞渗透调节能力，清除活性氧，减轻细胞膜氧化损伤[16-17]。本研究中，油菜在正常条件下培养，Car和脯氨酸的含量较低，但是当遇到低温胁迫时，Car和脯氨酸含量显著上升，在恢复过程中，随着细胞 O-2· 的生成速率和MDA含量的下降，Car和脯氨酸的含量也开始下降，说明Car和脯氨酸在油菜响应低温胁迫、清除活性氧以避免细胞遭到氧化胁迫中发挥了重要作用。刘卫琴等认为ALA处理对正常条件生长草莓叶片的Car含量没有明显影响[19]，本研究常温下喷施ALA的Car的含量没有变化的结果与其一致。另外，本研究发现ALA处理增加了低温胁迫下油菜叶片Car含量。低温胁迫下，Car可以保护Chl分子，避免Chl被氧化，增强植株抗低温能力[15]。这可能是ALA处理的油菜叶片能保持较高的叶绿素含量与抗冷性增强的一个原因。谷氨酸是脯氨酸和ALA合成的共同前体，Averina等认为盐胁迫下，加入外源ALA后，内源ALA的合成下降，使谷氨酸转向合成脯氨酸，脯氨酸大量积累，从而增加了大麦的耐盐性[20]。尹璐璐等报道ALA提高黄瓜幼苗的抗冷性，与脯氨酸积累量增加、MDA含量减少有关[7]。本研究中ALA处理提高低温胁迫下油菜叶片的脯氨酸含量和增加油菜耐低温能力的结果与其类似。

综上所述，喷施ALA增强了油菜植株的抗氧化能力，降低了 O-2· 的生成速率，抑制膜脂过氧化的产生，促进了低温胁迫下油菜Chl的合成。喷施ALA明显提高油菜幼苗的抗冷性，并能够促进油菜在受到低温胁迫后迅速恢复。

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