铁皮石斛丛生芽增殖和生长影响因素的研究

苏江+岑忠用+吴月圆+覃勇荣

摘要：以铁皮石斛丛生芽为材料，通过研究不同基本培养基、碳源及天然有机复合物等若干因子对铁皮石斛丛生芽增殖分化及壮苗生根的影响，筛选出适宜铁皮石斛组培苗快速繁殖的最佳配方，试图建立铁皮石斛组培苗的无菌繁殖系。研究结果表明，铁皮石斛丛生芽增殖分化的最适培养基为N6培养基，植株生长健壮；最适碳源为蔗糖；壮苗生根的最适配方为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+25%香蕉汁+3%白糖，生根率较高。

关键词：铁皮石斛；丛生芽；增殖；生长

中图分类号： S567.23+9.043文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0036-03

收稿日期：2013-10-28

基金项目：广西教育厅项目（编号：2013YB207）；河池学院重点项目（编号：2012YBZ-N002）；广西高校重点实验室桂西北特色资源研究与开发实验室资助项目（编号：桂教科研[2010]6号）。

作者简介：苏江（1980—），女，广西宁明人，硕士，讲师，从事植物组织培养及相关生物技术研究。E-mail：suppersujiang@sina.com。石斛属是兰科植物中一个较大的属，全世界约110种，广泛分布于亚洲、欧洲和大洋洲等地。我国有74种2变种，分布于秦岭以南诸地区，尤其以云南南部为多。《中国药典》2005年版记载，能够入药的石斛有5种，其中以铁皮石斛（Dendrobium candidum）最为名贵。铁皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物，俗称铁皮枫斗，又名黑节草，因其表皮呈铁绿色而得名[1]。铁皮石斛主要生长在高山峻岭悬崖峭壁和岩石缝隙中，是一种分布在岩溶地区的珍贵中药材植物，民间有“救命仙草”“中华仙草”的美称[2]。铁皮石斛是一种生长缓慢、自身繁殖能力很低的兰科附生植物，对生长环境要求十分严格。铁皮石斛从开花授粉至果实成熟约需6个月，一般借助昆虫或外力异花传粉，因而授粉不良，结果甚少。在自然条件下，种子萌发因缺乏营养物质，需与真菌共生，以获得养分的供给才能完成萌发，发芽率极低。铁皮石斛种子极小，不含胚乳，自然繁殖十分困难，加上人为的过度采挖和破坏生境，其资源已濒临灭绝[3-6]。目前，为满足国内外市场对石斛药源的需要，须通过人工培育的方法快速繁殖铁皮石斛。

1材料与方法

1.1试验材料

由河池学院植物组织培养实验室提供的铁皮石斛无菌芽。

1.2试验方法

1.2.1不同基本培养基对铁皮石斛丛生芽增殖和生长的影响设3个处理，即以MS、1/2MS、N6为基本培养基，添加激素6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L，白糖3%，琼脂7.0 g/L，pH值5.8～6.0，每个处理0.5 L。

1.2.2不同碳源对铁皮石斛增殖丛生芽和生长的影响设3个处理，即以白糖3%、蔗糖3%、葡萄糖3%为碳源，添加至MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培养基上，琼脂 7.0 g/L，pH值5.8～6.0，每个处理0.5 L。

1.2.3不同附加物及浓度对铁皮石斛丛生芽增殖和壮苗生根的影响设6个处理，即以香蕉汁、马铃薯汁各15%、20%、25%为附加物，添加至MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培养基上，琼脂7.0 g/L，pH值5.8～6.0，每个处理 0.5 L。

1.3测定指标及方法

1.3.1石斛芽的增殖率增殖系数=培养45 d后获得不定芽数/接种外植体数。

1.3.2株高随机抽取3瓶材料，在无菌超净台上用加热器高温灭菌的镊子将石斛苗从培养瓶中取出，每瓶约取出10株，置于培养皿中待用。用尺子测量30株石斛苗的株高，记录数据。

1.3.4根数及根长随机抽取3瓶材料，在无菌超净台上从培养瓶中取出约30株石斛苗，放至培养皿中待用。用镊子辅助数出肉眼可见的根数，并用尺子测量其根长，记录数据。

2结果与分析

2.1不同基本培养基对丛生芽增殖和生长的影响

试验结果表明，在添加激素6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L，白糖3%，pH值5.8等同等条件下，铁皮石斛丛生芽增殖率从高到低排列为N6>1/2MS>MS，即以N6为基本培养基时最适合铁皮石斛丛生芽的增殖，增殖率最高，增殖系数达2.0，且芽叶片颜色浓绿，长势均匀整齐。1/2MS的增殖效果也很明显，增殖系数为1.9，但是石斛芽较矮小，颜色略带黄色。MS的效果最差，增殖率最低，但是MS培养基的石斛芽最健壮，茎的生长最明显（表1、图1、图2、图3）。

2.2不同碳源对铁皮石斛丛生芽增殖和生长的影响

试验结果表明：不同的碳源对铁皮石斛的增殖和丛生芽

生长有不同的效果（表2），其中蔗糖的增殖效果最好，葡萄糖次之，白糖的增殖效果最差。另外，从丛生芽生长的情况看，以蔗糖为碳源的丛生芽长势均匀、整齐健壮且颜色浓绿，平均株高达到2.42 cm；以白糖为碳源的丛生芽长势与以蔗糖为碳源的丛生芽长势相似，但平均株高仅为1.83 cm；以葡萄糖为碳源的丛生芽长势最差，其茎较细，颜色浅绿。

2.3不同附加物对铁皮石斛丛生芽增殖和壮苗生根的影响

不同的附加物对铁皮石斛丛生芽增殖和壮苗生根具有不同程度的影响。由表3可知，马铃薯汁更有利于促进丛生芽的增殖，增殖系数均达2.1以上，这有利于短期快速获得大量的试管苗，但褐化现象较严重（图4、图5、图6），对诱导生根也具有抑制作用。其中以马铃薯汁25%最有利于铁皮石斛的增殖，但芽长势较弱。不同浓度香蕉汁增殖效果均比马铃薯汁的差，且不同浓度的增殖效果差异不明显。

3讨论

3.1铁皮石斛丛生芽增殖和生长的最适基本培养基

本研究结果显示，N6为基本培养基时铁皮石斛丛生芽增殖效果较好，这与曾宋君等对5种石斛进行离体培养得出石

斛的通用最适培养基是改良N6培养基的结果[7]一致。MS为基本培养基时丛生芽增殖效果最差，但MS培养基对石斛茎生长有较好的促进作用，这与郭洪波的研究结果[8]相同。在比较MS、1/2MS、N6不同培养基对铁皮石斛生长的影响时发现，增殖明显的石斛芽茎生长不明显，反之，茎生长较好的增殖率不高。所以研究不同问题时，要根据需要选择适合的培养基，本研究认为N6培养基最适合铁皮石斛的增殖，而MS培养基较有利于茎的生长。

3.2铁皮石斛组培苗生长的最适碳源

在比较不同碳源对铁皮石斛生长的影响中，试验结果表明，蔗糖对石斛芽的增殖效果最好，长势整齐健壮，对株高的影响优于白糖和葡萄糖，这与魏梅娟等的研究结果[9]一致。从铁皮石斛的生长情况看，本研究还发现以白糖为碳源的丛生芽长势与以蔗糖为碳源的丛生芽长势相似，以葡萄为碳源的丛生芽长势最差，其茎较细，颜色浅绿。因此，本研究认为大规模工业化生产铁皮石斛组培苗时，在尽量保证苗质量的前提下，为了降低生产成本，以白糖作为碳源较合适。

3.3铁皮石斛壮苗生根的最适附加物及浓度

天然有机物是植物组织培养中常用的添加物[10]，在长期的组织培养实践中，人们发现在培养基内加入某些适当的天然有机添加物，能够增强培养物的生长、分化效应，促进培养物更好地存活、发育。植物组织培养中常用的天然有机添加物包括椰乳、香蕉汁、苹果汁、番茄汁、胡萝卜汁、马铃薯汁等[11]。本研究以香蕉汁和马铃薯汁为附加物，结果表明，香蕉汁和马铃薯汁对铁皮石斛丛生芽增殖和壮苗生根培养具有不同的影响。从增殖效果来看，马铃薯汁处理更有利于丛生芽的增殖，并以25%马铃薯汁的增殖效果最佳，这将有利于短期快速获得大量的试管苗；但马铃薯汁处理褐化现象较严重。增殖效果较差的是15%香蕉汁和20%香蕉汁。从根的

生长情况来看，香蕉汁处理的生根率、根数、根长都优于马铃薯汁处理，在培养65 d时，3个香蕉汁处理的平均根长都在 0.65 cm 以上，其中以添加25%香蕉汁处理的效果最好，其根长达0.84 cm。从丛生芽的生长情况来看，香蕉汁和马铃薯汁对铁皮石斛丛生芽的生长都有促进作用，在培养65 d时各处理的平均株高达到1.86～2.1 cm，且香蕉汁处理的平均株高均稍大于马铃薯汁处理，其中25%香蕉汁处理的株高最大，为2.1 cm。综合试验结果，本研究认为，香蕉汁比马铃薯汁更有利于铁皮石斛壮苗生根培养，且以25%香蕉汁处理效果最佳，这可能是香蕉汁和马铃薯汁所含的成分不同所致，有关这方面还需进一步研究。

参考文献：

[1]王宪楷，赵同芳. 石斛属植物的化学成分与中药石斛[J]. 中国药学杂志，1986，21（11）：666-669.

[2]杨一令，来平凡，蒋士鹏. 铁皮石斛的研究进展[J]. 山东中医药大学学报，2008，32（1）：82-85.

[3]淳泽. 药用石斛的资源危机与保护对策[J]. 资源开发与市场，2005，21（2）：139-140.

[4]刘瑞驹，蒙爱东，邓锡青，等. 铁皮石斛试管苗快速繁殖的研究[J]. 药学学报，1988，23（8）：636-640.

[5]张治国，刘烨，王黎，等. 铁皮石斛原球茎增殖的培养条件研究[J]. 中草药，1992，23（8）：431-433.

[6]廖俊杰，许继勇，李进进，等. 铁皮石斛试管种苗产业化生产的技术因素分析[J]. 中药材，2006，29（6）：533-535.

[7]曾宋君，程式君，张京丽，等. 五种石斛兰的胚培养及其快速繁殖研究[J]. 园艺学报，1998，25（1）：76-81.

[8]郭洪波. 铁皮石斛（Dendrobium candidum）组培快繁及其抗癌作用的研究[D]. 沈阳：沈阳农业大学，2008：3-10.

[9]魏梅娟，李 雪，叶清梅，等. 铁皮石斛组培苗生长的影响因素研究[J]. 北方园艺，2011（2）：146-148.

[10]曹孜义，刘国民. 实用植物组织培养技术教程[M]. 兰州：甘肃科学技术出版社，2002：85-126.

[11]刘晓燕，向青云，刘玲玲，等. 基本培养基及附加物对蝴蝶兰原球茎增殖效果的影响[J]. 种子，2005，24（6）：18-20，26.

本研究结果显示，N6为基本培养基时铁皮石斛丛生芽增殖效果较好，这与曾宋君等对5种石斛进行离体培养得出石

斛的通用最适培养基是改良N6培养基的结果[7]一致。MS为基本培养基时丛生芽增殖效果最差，但MS培养基对石斛茎生长有较好的促进作用，这与郭洪波的研究结果[8]相同。在比较MS、1/2MS、N6不同培养基对铁皮石斛生长的影响时发现，增殖明显的石斛芽茎生长不明显，反之，茎生长较好的增殖率不高。所以研究不同问题时，要根据需要选择适合的培养基，本研究认为N6培养基最适合铁皮石斛的增殖，而MS培养基较有利于茎的生长。

3.2铁皮石斛组培苗生长的最适碳源

在比较不同碳源对铁皮石斛生长的影响中，试验结果表明，蔗糖对石斛芽的增殖效果最好，长势整齐健壮，对株高的影响优于白糖和葡萄糖，这与魏梅娟等的研究结果[9]一致。从铁皮石斛的生长情况看，本研究还发现以白糖为碳源的丛生芽长势与以蔗糖为碳源的丛生芽长势相似，以葡萄为碳源的丛生芽长势最差，其茎较细，颜色浅绿。因此，本研究认为大规模工业化生产铁皮石斛组培苗时，在尽量保证苗质量的前提下，为了降低生产成本，以白糖作为碳源较合适。

3.3铁皮石斛壮苗生根的最适附加物及浓度

天然有机物是植物组织培养中常用的添加物[10]，在长期的组织培养实践中，人们发现在培养基内加入某些适当的天然有机添加物，能够增强培养物的生长、分化效应，促进培养物更好地存活、发育。植物组织培养中常用的天然有机添加物包括椰乳、香蕉汁、苹果汁、番茄汁、胡萝卜汁、马铃薯汁等[11]。本研究以香蕉汁和马铃薯汁为附加物，结果表明，香蕉汁和马铃薯汁对铁皮石斛丛生芽增殖和壮苗生根培养具有不同的影响。从增殖效果来看，马铃薯汁处理更有利于丛生芽的增殖，并以25%马铃薯汁的增殖效果最佳，这将有利于短期快速获得大量的试管苗；但马铃薯汁处理褐化现象较严重。增殖效果较差的是15%香蕉汁和20%香蕉汁。从根的

生长情况来看，香蕉汁处理的生根率、根数、根长都优于马铃薯汁处理，在培养65 d时，3个香蕉汁处理的平均根长都在 0.65 cm 以上，其中以添加25%香蕉汁处理的效果最好，其根长达0.84 cm。从丛生芽的生长情况来看，香蕉汁和马铃薯汁对铁皮石斛丛生芽的生长都有促进作用，在培养65 d时各处理的平均株高达到1.86～2.1 cm，且香蕉汁处理的平均株高均稍大于马铃薯汁处理，其中25%香蕉汁处理的株高最大，为2.1 cm。综合试验结果，本研究认为，香蕉汁比马铃薯汁更有利于铁皮石斛壮苗生根培养，且以25%香蕉汁处理效果最佳，这可能是香蕉汁和马铃薯汁所含的成分不同所致，有关这方面还需进一步研究。

参考文献：

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[5]张治国，刘烨，王黎，等. 铁皮石斛原球茎增殖的培养条件研究[J]. 中草药，1992，23（8）：431-433.

[6]廖俊杰，许继勇，李进进，等. 铁皮石斛试管种苗产业化生产的技术因素分析[J]. 中药材，2006，29（6）：533-535.

[7]曾宋君，程式君，张京丽，等. 五种石斛兰的胚培养及其快速繁殖研究[J]. 园艺学报，1998，25（1）：76-81.

[8]郭洪波. 铁皮石斛（Dendrobium candidum）组培快繁及其抗癌作用的研究[D]. 沈阳：沈阳农业大学，2008：3-10.

[9]魏梅娟，李 雪，叶清梅，等. 铁皮石斛组培苗生长的影响因素研究[J]. 北方园艺，2011（2）：146-148.

[10]曹孜义，刘国民. 实用植物组织培养技术教程[M]. 兰州：甘肃科学技术出版社，2002：85-126.

[11]刘晓燕，向青云，刘玲玲，等. 基本培养基及附加物对蝴蝶兰原球茎增殖效果的影响[J]. 种子，2005，24（6）：18-20，26.

本研究结果显示，N6为基本培养基时铁皮石斛丛生芽增殖效果较好，这与曾宋君等对5种石斛进行离体培养得出石

斛的通用最适培养基是改良N6培养基的结果[7]一致。MS为基本培养基时丛生芽增殖效果最差，但MS培养基对石斛茎生长有较好的促进作用，这与郭洪波的研究结果[8]相同。在比较MS、1/2MS、N6不同培养基对铁皮石斛生长的影响时发现，增殖明显的石斛芽茎生长不明显，反之，茎生长较好的增殖率不高。所以研究不同问题时，要根据需要选择适合的培养基，本研究认为N6培养基最适合铁皮石斛的增殖，而MS培养基较有利于茎的生长。

3.2铁皮石斛组培苗生长的最适碳源

在比较不同碳源对铁皮石斛生长的影响中，试验结果表明，蔗糖对石斛芽的增殖效果最好，长势整齐健壮，对株高的影响优于白糖和葡萄糖，这与魏梅娟等的研究结果[9]一致。从铁皮石斛的生长情况看，本研究还发现以白糖为碳源的丛生芽长势与以蔗糖为碳源的丛生芽长势相似，以葡萄为碳源的丛生芽长势最差，其茎较细，颜色浅绿。因此，本研究认为大规模工业化生产铁皮石斛组培苗时，在尽量保证苗质量的前提下，为了降低生产成本，以白糖作为碳源较合适。

3.3铁皮石斛壮苗生根的最适附加物及浓度

天然有机物是植物组织培养中常用的添加物[10]，在长期的组织培养实践中，人们发现在培养基内加入某些适当的天然有机添加物，能够增强培养物的生长、分化效应，促进培养物更好地存活、发育。植物组织培养中常用的天然有机添加物包括椰乳、香蕉汁、苹果汁、番茄汁、胡萝卜汁、马铃薯汁等[11]。本研究以香蕉汁和马铃薯汁为附加物，结果表明，香蕉汁和马铃薯汁对铁皮石斛丛生芽增殖和壮苗生根培养具有不同的影响。从增殖效果来看，马铃薯汁处理更有利于丛生芽的增殖，并以25%马铃薯汁的增殖效果最佳，这将有利于短期快速获得大量的试管苗；但马铃薯汁处理褐化现象较严重。增殖效果较差的是15%香蕉汁和20%香蕉汁。从根的

生长情况来看，香蕉汁处理的生根率、根数、根长都优于马铃薯汁处理，在培养65 d时，3个香蕉汁处理的平均根长都在 0.65 cm 以上，其中以添加25%香蕉汁处理的效果最好，其根长达0.84 cm。从丛生芽的生长情况来看，香蕉汁和马铃薯汁对铁皮石斛丛生芽的生长都有促进作用，在培养65 d时各处理的平均株高达到1.86～2.1 cm，且香蕉汁处理的平均株高均稍大于马铃薯汁处理，其中25%香蕉汁处理的株高最大，为2.1 cm。综合试验结果，本研究认为，香蕉汁比马铃薯汁更有利于铁皮石斛壮苗生根培养，且以25%香蕉汁处理效果最佳，这可能是香蕉汁和马铃薯汁所含的成分不同所致，有关这方面还需进一步研究。

参考文献：

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[4]刘瑞驹，蒙爱东，邓锡青，等. 铁皮石斛试管苗快速繁殖的研究[J]. 药学学报，1988，23（8）：636-640.

[5]张治国，刘烨，王黎，等. 铁皮石斛原球茎增殖的培养条件研究[J]. 中草药，1992，23（8）：431-433.

[6]廖俊杰，许继勇，李进进，等. 铁皮石斛试管种苗产业化生产的技术因素分析[J]. 中药材，2006，29（6）：533-535.

[7]曾宋君，程式君，张京丽，等. 五种石斛兰的胚培养及其快速繁殖研究[J]. 园艺学报，1998，25（1）：76-81.

[8]郭洪波. 铁皮石斛（Dendrobium candidum）组培快繁及其抗癌作用的研究[D]. 沈阳：沈阳农业大学，2008：3-10.

[9]魏梅娟，李 雪，叶清梅，等. 铁皮石斛组培苗生长的影响因素研究[J]. 北方园艺，2011（2）：146-148.

[10]曹孜义，刘国民. 实用植物组织培养技术教程[M]. 兰州：甘肃科学技术出版社，2002：85-126.

[11]刘晓燕，向青云，刘玲玲，等. 基本培养基及附加物对蝴蝶兰原球茎增殖效果的影响[J]. 种子，2005，24（6）：18-20，26.