超高效液相色谱-串联质谱法快速测定8种蔬菜中114种农药残留

郭春景，李 娜，王建忠

(1. 辽宁省农业科学院开放实验室，辽宁 沈阳 110161；2. 天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300381)

超高效液相色谱-串联质谱法快速测定8种蔬菜中114种农药残留

郭春景1，李 娜2，王建忠1

(1. 辽宁省农业科学院开放实验室，辽宁 沈阳 110161；2. 天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300381)

建立了一种超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)快速测定叶菜类(油菜、芹菜)、甘蓝类(甘蓝)、根茎类(茎用莴苣、胡萝卜)、茄果类(辣椒、番茄)、豆类(豇豆)5大类8种蔬菜中114种农药的多残留检测方法。改进了QuEChERS前处理方法，样品用乙腈提取，C18、NH2、GCB混合粉末净化，正离子多反应监测(MRM)模式测定。结果表明：114种农药的检出限均低于8.0 μg/kg，在各自的浓度范围内线性关系良好，相关系数r2均大于0.99。8种蔬菜的平均回收率在76.5%～96.5%之间，相对标准偏差(RSD)在7.1%～11.6%之间。该方法简便、快速、准确、灵敏、节省有机溶剂，能够满足农药多残留检测的实际需求。

QuEChERS方法；超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)；农药多残留分析；蔬菜

随着农药的品种和数量急剧增加，农药残留所带来的环境问题和食品安全问题引起了人们的广泛关注。开发简单、快速、准确的农药多残留分析方法已成为检测技术人员关注的热点。

目前，农药残留分析的样品前处理多采用溶剂萃取、固相萃取等方法[1-6]，需大量使用价格昂贵、易挥发的有机溶剂，对人类健康和生存环境产生不利影响。并且，农药多残留研究多针对某一类农药，如有机磷类[7-9]、拟除虫菊酯类[10]、吡啶类[11]、磺酰脲类[12]、真菌毒素[13]、氨基甲酸酯类[14-15]、植物生长调节剂[16]等；或针对单一基质，如土壤[17]、鸡肝[18]、大豆[19]等；而针对多种蔬菜基质，并以实际使用的多种农药为研究对象，利用QuEChERS-UPLC-MS/MS进行分析的文献较少[9,16,20-22]。本研究以5大类8种蔬菜(豇豆、甘蓝、油菜、芹菜、茎用莴苣、辣椒、番茄和胡萝卜)为研究对象，这些样品基本涵盖了人们日常消费的蔬菜品种，且基本包括了蔬菜的不同生育特点，基质干扰差异较大。选择在蔬菜种植过程中可能使用的国内外禁用(或限用)，且不适于GC、GC/MS检测的114种农药为检测对象，通过改进的QuEChERS方法进行前处理，利用UPLC-MS/MS检测，旨为开展此类农药残留的监测和农产品安全管理提供一定的参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Waters UPLC-Xezo-TQ超高效液相色谱-串联质谱仪：美国Waters公司产品；中佳HC-3514高速离心机：安徽中科中佳科技有限公司产品；鼎昊源RS-1涡旋混合器：北京鼎昊源科技有限公司产品；帕恩特超纯水机：北京湘顺源科技有限公司产品。

1.2 主要材料与试剂

氯化钠(分析纯)：上海国药集团产品；PSA、C18、GCB、NH2粉：天津博纳艾杰尔科技有限公司产品；针头过滤器(0.22 μm)、聚丙烯塑料离心管(50 mL、10 mL)：新康医疗器械有限公司产品；甲醇、乙腈、甲酸(均为色谱纯)：北京迪马科技有限公司产品；实验用水为超纯水；农药标准品(纯度>97%)：德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司产品；蔬菜(豇豆、甘蓝、油菜、芹菜、茎用莴苣、辣椒、番茄、胡萝卜)：市售蔬菜。

1.3 标准溶液的配制

1.3.1 标准储备液的配制 分别称取适量各种农药标准品(精确至0.01 mg)，置于50 mL容量瓶中，根据标准品的溶解性选择甲醇、乙腈或V(丙酮)∶V(正己烷)= 1∶1的溶液溶解并定容，配制成浓度为200 mg/L的标准储备液，-18 ℃下保存。

1.3.2 混合标准使用液的配制 使用时移取一定量的标准储备液于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，根据各农药在仪器上的响应值确定上机浓度，混合标准溶液在4 ℃避光保存。

1.4 实验条件

1.4.1 色谱条件 Acquity BEH RP18柱 (2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；柱温30 ℃；进样10 μL；流速0.20 mL/min；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱条件：0～20 min、95%A～5%A，20～22 min、5%A～ 95%A。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，离子源温度110 ℃，毛细管电压3.0 kV，脱溶剂气温度380 ℃，雾化气流量550 L/h，锥孔反吹气流量50 L/h，扫描方式为多反应监测(MRM)模式。实验条件与结果列于表1。

1.5 样品前处理

称样5.00 g，加入10 mL乙腈，涡旋提取2 min，加1 g氯化钠，涡旋1 min，以4 000 r/min离心5 min，乙腈相和水相分层；取2 mL上层乙腈溶液于装有50 mg NH2，50 mg C18，10 mg GCB的10 mL离心管中，涡旋1 min，静置；取0.5 mL上清液，加入0.5 mLV(甲醇)∶V(水)=50∶50的溶液，混匀，过0.22 μm有机滤膜，待测。

2 结果与讨论

最初的QuEChERS方法处理过程为：称取10 g样品，加入10 mL乙腈进行提取，然后加入4 g硫酸镁和1 g氯化钠进行盐析分层，取1 mL上清液，加入150 mg硫酸镁和25 mg PSA进行净化，净化后的上清液直接上机分析。本研究通过对流动相、提取剂种类、吸附剂种类、吸附剂用量、上机定容溶液等条件的优化，确定了适用于本实验的QuEChERS前处理方法。

2.1 流动相的选择

分别比较甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水作为流动相的效果。在相同的梯度洗脱条件下，乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时，目标物离子化效果最好，色谱峰尖锐、对称，响应灵敏度高，农药分离效果最好。所以，选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

2.2 提取剂的选择

分别对乙腈、丙酮、1%醋酸乙腈[20]的提取效果进行比较。结果表明：乙腈的提取效果最好，农药回收率较高，基质干扰较少；丙酮提取的基质干扰较多，不利于后续的净化；采用1%醋酸乙腈溶液提取时，酸性和中性农药的回收率较好，但部分碱性农药(如甲草胺、嘧霉胺等)的提取效果较差。为满足不同pH值农药回收率的要求，最终选择乙腈为提取剂。

2.3 吸附剂种类的选择

选择常用的GCB、NH2、PSA、C18四种吸附剂进行比较，其中GCB用于去除色素类杂质，PSA和NH2用于去除极性杂质，C18用于去除非极性杂质。QuEChERS方法中选用PSA作为净化剂。本研究考察了GCB、NH2、C18混合粉末和GCB、PSA、C18混合粉末两种净化方案。实验结果表明，PSA和NH2有相同的吸附原理，二者的净化效果并无明显区别。PSA是一种弱阴离子交换吸附剂，能通过形成氢键去除脂肪酸、糖及其他基质干扰。虽然由于PSA同时存在伯胺、仲胺而具有更高的去杂质能力，但PSA对含羧酸基团、含氟、含氯物质有保留。所以，本研究选择GCB、NH2、C18混合粉末取代QuEChERS方法中的PSA对样品进行净化，得到了满意的净化效果。

2.4 吸附剂用量的选择

首先在2 mL样品液中分别加入5、10、15、20、30 mg GCB，来确定去除色素的合适用量。结果表明，加入10 mg GCB的效果最好，能有效去除色素，样液澄清，对仪器污染最小。当用量小于10 mg时，达不到去除色素的效果；当用量大于10 mg时，有些农药(如蝇毒磷、特丁津、氯吡脲)会因被吸附而使回收率降低。

样液中加入10 mg GCB，再分别加入30、50、100 mg NH2和C18，以比较不同用量对净化效果的影响。结果发现，NH2和C18的不同用量对净化结果的影响不大，而50 mg的NH2和C18用量，净化效果最好，回收率最高。所以，选择10 mg GCB、50 mg NH2、50 mg C18为最终的吸附剂用量。

2.5 上机定容溶液的选择

比较了甲醇、乙腈、不同体积分数的甲醇-0.1%甲酸水溶液(甲醇与0.1%甲酸水的体积比分别为80∶20、70∶30、60∶40)对农药的响应值和色谱峰形的影响。

结果表明：定容溶液中有机相比例较高时，极性强的农药色谱峰出现前延现象；定容溶液中有机相比例较低时，溶解效果不佳，极性弱的农药响应值会降低。实验最终确定定容溶液中有机相的比例为75%。有机相选用甲醇或乙腈对实验结果无明显影响。所以，最终选择0.5 mL乙腈，加0.5 mLV(甲醇)∶V(水)= 50∶50的溶液定容，上机测定。

从这一结果可以看出，当溶液中含有适量水分时，农药的响应值和色谱峰形更好。所以，在进行前处理盐析步骤时，能够起到良好的分离效果即可，没必要把水除尽。

2.6 线性范围和最低检出限

通过对8种蔬菜基质的比较，发现豇豆基质最为复杂，所以采用以豇豆为空白基质添加不同浓度的混合标准溶液，通过添加较低的浓度点，以3倍信噪比(S/N=3)计算检出限(LOD)。根据检出限结果，以10倍信噪比(S/N=10)计算定量限(LOQ)。向豇豆基质中添加不同浓度的混合标准溶液，通过农药的响应信号和回收率确定不可靠的浓度阈值，从而确定农药各组分的定量限，具体结果已于表1中列出。其中，除涕灭威(包括涕灭威砜、涕灭威亚砜)、硫双威、活化酯、甲基乙拌磷、利谷隆、乙呋草黄、咯菌清、醚菌酯的检出限大于等于2.0 μg/kg、定量限大于等于20 μg/kg外，其他农药的检出限均不大于1.0 μg/kg、定量限均不大于10 μg/kg。

以确定的定量限(LOQ)为基础，以豇豆为基质配制标准曲线。可以看出，114种农药在各自的浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均在0.99以上。

2.7 回收率和精密度

考虑到国内绝大多数农药残留限量均大于10 μg/kg，所以向豇豆空白样品中分别添加10、50、100 μg/kg三个水平，平行分析5次，计算回收率和相对标准偏差。其中，涕灭威(包括涕灭威砜、涕灭威亚砜)、硫双威、活化酯、甲基乙拌磷、利谷隆、乙呋草黄、咯菌清、醚菌酯的定量限大于等于20 μg/kg，所以，只需考虑定量限以上的添加浓度结果。结果表明，在3种添加水平下，114种农药的平均回收率在75.0%～106.0%之间，相对标准偏差在5.8%～14.0%之间，可以满足农残检测要求。

2.8 基质效应的影响

通过对豇豆样品的分析，可以看出该方法适用于豇豆样品的农药多残留检测。为了验证该方法对其他蔬菜样品中农药多残留检测的效果，分别选择甘蓝、油菜、芹菜、茎用莴苣、辣椒、番茄和胡萝卜7种蔬菜进行基质效应对实验方法影响的分析，实验的平均回收率和相对标准偏差列于表2。实验中添加浓度分别为10、50、100 μg/kg，对于定量限高的个别农药，只考虑定量限以上的添加浓度结果。表2中的数据说明，该方法同样适用于甘蓝、油菜、芹菜、茎用莴苣、辣椒、番茄和胡萝卜中农药多残留的检测。

表2 七种蔬菜的平均回收率和相对标准偏差

3 结论

本研究选择不适于GC、GC/MS检测的114种农药为检测对象，建立了8种蔬菜中多种农药残留的快速检测方法。

与传统的QuEChERS方法相比，本实验的盐析过程中未使用硫酸镁，仅选择更为廉价的氯化钠。这是因为在上机定容溶液的选择中发现，含少量水分对农药的响应信号和色谱峰形有所改善，所以对于LC/MS检测，盐析过程能够起到良好的分离效果即可，没必要把水除尽。实验还发现，选择NH2、C18、GCB 混合粉末代替传统QuEChERS 方法中的PSA，净化效果更好。

114 种农药的检出限在0.1～8 μg/kg 之间，定量限在5～100 μg/kg之间，平均回收率在76.5%～96.5%之间，相对标准偏差在7.1%～11.6%之间，在各自的浓度范围内线性关系良好，相关系数r2大于0.99。由于所选蔬菜基本覆盖日常生活中的常用品种，具有一定的代表性，因此该方法在农药残留定量分析中有很好的推广前景。

该方法提取时间短、溶剂用量少、回收率高、检测成本相对较低，适合于不同种类蔬菜中多种农药残留的检测，这可为农药残留检测工作提供新的技术支持。

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Rapid Detection of 114 Pesticide Residues in Eight Vegetables by UPLC-MS/MS

GUO Chun-jing1, LI Na2, WANG Jian-zhong1

(1.OpeningLaboratoryofLiaoningAcademyofAgriculturalSciences,Shenyang110161,China;2.TianjinInstituteofAgriculturalQualityStandardandTestingTechnology,Tianjin300381,China)

114 kinds of pesticide residues in five categories of eight vegetables， including leafy vegetables (rape, celery), cabbage vegetables (cabbage), root vegetables (stem lettuce, carrots), solanaceous vegetables (peppers, tomatoes), legumes (cowpeas) were determined using a improved QuEChERS and UPLC-MS/MS. The samples were extracted by acetonitrile, cleaned up by C18, NH2, GCB mixed powder, and analyzed by the positive ion multiple reaction monitoring (MRM) mode. The results show that the detection limits of 114 kinds pesticides are under 8.0 μg/kg, which have good linearity in their concentrations. The correlation coefficients are greater than 0.99. The average recoveries of eight vegetables are between 76.5% and 96.5%, and the relative standard deviations (RSDs) are between 7.1% and 11.6%. The method is simple, rapid, accurate, sensitive, saving organic solvents, which can meet the demands of practical used for multi-residue pesticides.

QuEChERS; UPLC-MS/MS; multi-residue of pesticides analysis; vegetables

2013-12-23；

2014-01-24

辽宁省“十二五”科技攻关项目“农产品质量安全检验检测技术”(2011215004)资助

郭春景(1982～)，女(汉族)，辽宁阜新人，助理研究员，从事农产品检测及色谱方法研究。E-mail：guocj464@qq.com

王建忠(1972～)，男(汉族)，江苏连云港人，研究员，从事农产品质量安全检测工作。E-mail：wjz721125@sina.com

O 657.63

A

1004-2997(2014)03-0279-10

10.7538/zpxb.2014.35.03.0279