大鼠血清网膜素-1水平与胰岛素抵抗的相关性*

王楠楠， 赵晓娟△， 陈 薇， 白淑亭， 杨博文

(中国医科大学附属第一医院 1内分泌科， 2流行病科，辽宁 沈阳 110001)

大鼠血清网膜素-1水平与胰岛素抵抗的相关性*

王楠楠1， 赵晓娟1△， 陈 薇1， 白淑亭1， 杨博文2

(中国医科大学附属第一医院1内分泌科，2流行病科，辽宁 沈阳 110001)

目的： 建立胰岛素抵抗大鼠模型，探讨血清网膜素-1水平与胰岛素抵抗的相关性。方法：30只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC，n=15)、高脂饮食组(HF，n=15)，自由摄食、饮水，NC组给予普通饲料，HF组给予高脂饲料诱导胰岛素抵抗模型。10周后2组各取5只行高胰岛素正葡萄糖钳夹实验评估模型，ELISA法检测血清网膜素-1，放射免疫法检测血清基础胰岛素。结果：(1)各组大鼠基础血糖比较无显著差异(P>0.05)。(2)HF组血清基础胰岛素水平较NC组明显升高(P<0.05)，但血清网膜素-1水平较NC组明显降低(P<0.01)。(3)Pearson相关性分析示血清网膜素-1分别与胰岛素(r=-0.654，P<0.01)和游离脂肪酸(r=-0.446，P<0.05)呈负相关。结论：在大鼠胰岛素抵抗阶段，血清网膜素-1水平已经开始降低；基础胰岛素水平随着血清网膜素-1水平的降低而升高，推测血清网膜素-1水平降低可能成为胰岛素抵抗、糖尿病及心血管疾病的早期提示因子。

胰岛素抵抗； 高胰岛素正葡萄糖钳夹； 网膜素-1

胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)不仅是糖尿病的病因之一，也是高血压、血脂异常及动脉粥样硬化的共同危险因素。近期研究表明，脂肪组织通过多种脂肪内分泌激素，参与能量代谢、胰岛素抵抗、炎症反应、动脉粥样硬化等病理生理过程。网膜素-1(omentin-1)是特异性表达于网膜脂肪组织的细胞因子，可改善胰岛素敏感性，参与胰岛素抵抗相关的糖代谢调节[1]。在肥胖、糖尿病及多囊卵巢综合征等患者体内呈低表达水平[2-3]。随着研究的进展，发现网膜素-1还具有抗炎、舒张血管作用[4]。本文旨在探讨大鼠血清网膜素-1水平与胰岛素抵抗相关性。

材 料 和 方 法

1 实验动物、主要试剂与仪器

SPF级雄性Wistar大鼠30只(辽宁长生生物技术有限公司)，体重(230±20)g，饲养于中国医科大学实验动物中心屏障系统中，室温21～25 ℃，湿度60%左右，明暗交替周期12 h，自由摄食、饮水。以基础饲料适应性喂养1周。

胰岛素放射免疫分析药盒购于原子高科股份有限公司；大鼠血清网膜素-1 ELISA试剂盒(R&D)检测范围为1.5 ng/L～400 ng/L；微量输液泵；全波长酶标仪；紫外分光光度仪。

2 实验方法

2.1 建立胰岛素抵抗大鼠模型 大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组(NC，n=15)和高脂饮食组(HF，n=15)。正常对照组给予基础饲料喂养，高脂饮食组给予高脂饲料喂养，诱导胰岛素抵抗模型。基础饲料热量比：蛋白质28.58%，脂肪9.59%，碳水化合物61.83%。高脂饲料配方如下：基础饲料+猪油+奶粉，热量比为蛋白质14%，脂肪59%，碳水化合物27%。

2.2 高胰岛素正葡萄糖钳夹实验 动物喂养10周以后，NC组、HF组随机各抽取5只大鼠，采用高胰岛素正葡萄糖钳夹实验，评估胰岛素抵抗模型，具体方法参照文献[5]实施。首先输注胰岛素，输注率1.67 mU·kg-1·min-1，每5 min在颈动脉取1滴血测血糖。当血糖<基础值±0.5 mmol/L时开始输注葡萄糖。葡萄糖输注率(glucose infusion rate，GIR)从4～6 kg/min开始，每5 min测血糖1次，调整GIR，使血糖保持在基础值±0.5 mmol/L。连续3次血糖都在上述范围内，钳夹形成。实验共计约2 h，计算60～120 min的平均GIR，以评价胰岛素的敏感性。

2.3 标本采集 在大鼠禁食14 h后，测定空腹血糖；予10%水合氯醛麻醉(腹腔注射)，内眦静脉采血，分离血清，应用胰岛素放免药盒检测血清胰岛素水平，ELISA法测定血清网膜素-1和游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)水平。钳夹实验结束后剖杀动物，心脏穿刺取血，分离血清，-70 ℃冰箱保存；完整剥离大鼠附睾脂肪，称重，计算附睾脂肪质量占体质量的比例(g/g)，即附睾脂肪质量指数。

2.4 ELISA法测定血清网膜素-1和FFA水平 实验前将试剂盒及血清样品平衡至室温，确定所需的酶标包被板的数目，标准品孔、空白孔及样品孔均做复孔，严格按照说明书操作，以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(A值)。根据标准品的浓度及对应的A值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的A值在回归方程上计算出相应的样品浓度。

3 统计学处理

应用SPSS 16.0软件进行分析，所有数据均用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间各指标均数的比较用t检验，正态分布资料的相关性采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠体重及附睾脂肪质量指数

附睾脂肪质量指数常用于评估内脏脂肪含量，本实验大鼠喂养10周后，HF组较NC组体重、附睾脂肪质量指数明显升高(P<0.01)，提示长期高脂饮食导致的大鼠肥胖为内脏脂肪性肥胖，见表1。

表1 高脂饮食对大鼠体重和附睾脂肪质量指数的影响

Table 1.Weight and epididymal fat mass index in NC group and HF group (Mean±SD.n=10)

GroupWeight(g)Epididymalfatmassindex(%)NC513.41±46.500.75±0.12HF585.23±32.64**1.12±0.10**

NC: normal control; HF: high-fat diet.**P<0.01vsNC.

2 高胰岛素正葡萄糖钳夹实验

喂养10周后行钳夹实验，HF组大鼠平均GIR为(1.19±0.32) mg·kg-1·min-1，显著低于NC组(3.95±0.31) mg·kg-1·min-1(P<0.01)，提示胰岛素抵抗大鼠模型建立成功。

3 空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、血清基础胰岛素(insulin,INS)和血清网膜素-1水平的变化

各组大鼠基础血糖比较无显著差异(P>0.05)。HF组的血清基础胰岛素较NC组明显升高(P<0.05)，血清网膜素-1明显降低(P<0.01)，见表2。

4 部分指标的相关性分析

Pearson相关性分析结果显示：血清网膜素-1分别与INS (r=-0.654,P<0.01)和FFA (r=-0.446,P<0.05)呈负相关，但血清网膜素-1与体重和附睾脂肪质量指数无明显相关性，见图1。

表2 高脂饮食对大鼠FBG、INS、omentin-1 和FFA水平的影响

NC: normal control; HF: high-fat diet; FBG: fasting blood glucose; INS: insulin; FFA: free fatty acids.*P<0.05,**P<0.01vsNC.

Figure 1.The result of correlation analysis between omentin-1 with INS (A) and FFA (B).

图1 Omentin-1与胰岛素及FFA的相关分析

讨 论

附睾脂肪质量指数常用于评估内脏脂肪含量，本实验结果表明高脂饮食组明显高于正常饮食组，提示长期高脂饮食导致的大鼠肥胖为内脏脂肪性肥胖。相关研究表明，肥胖者葡萄糖利用障碍，胰岛素抑制肝糖产生作用降低，游离脂肪酸代谢增高可影响葡萄糖的利用。上述均可导致胰岛素抵抗，为满足机体糖代谢需求，需分泌更多的胰岛素造成高胰岛素血症，而高胰岛素血症可以使脂肪细胞合成增加，分解减少。因此，高胰岛素血症和高游离脂肪酸是肥胖者胰岛素抵抗的重要特征，本研究测得IR大鼠的血清基础胰岛素、游离脂肪酸水平均明显高于NC组，与这一特征一致。

网膜素的基因位于染色体1q22～23，这一区域是糖尿病致病基因的候选区[1]。相关研究发现，其调节糖代谢的主要机制为促进脂肪细胞胰岛素介导的葡萄糖摄取作用，并促进胰岛素受体后信号通路中的Akt磷酸化，即可增加脂肪细胞的胰岛素敏感性。因此随着网膜素-1水平的降低胰岛素敏感性下降，导致高胰岛素血症，进而发生胰岛素抵抗，促进糖尿病及心血管疾病的发生发展。

研究发现，在肥胖、多囊卵巢综合征、糖耐量减低、1型糖尿病和2型糖尿病患者中，血清网膜素-1水平、网膜脂肪组织中网膜素-1的mRNA表达水平和蛋白含量均明显降低，且网膜组织网膜素-1基因的表达和分泌受到胰岛素和葡萄糖的抑制，并呈剂量依赖性[2-3, 6]。Wurm等[7]对12例正常体重、胰岛素敏感的正常人进行严格的OGTT试验，发现网膜素-1与空腹和餐后的血糖水平没有明显的相关性。上述研究表明，短时的葡萄糖摄取增多并未引起血清网膜素-1发生明显波动，但是持续的高血糖状态及高胰岛素水平对其基因表达与蛋白合成有下调作用[2-3, 6-7]。

在人群调查中，发现网膜素-1有比较一致的结果，我们期望进一步研究这一现象的功能及机制，因此动物模型的建立及实验相当重要。本研究采用高脂饲料喂养大鼠10周后成功建立胰岛素抵抗模型，测得IR组大鼠血清网膜素-1水平较NC组明显减低，Pearson相关性分析结果示血清网膜素-1与基础胰岛素呈明显负相关，表明在大鼠胰岛素抵抗阶段，血清网膜素-1水平已经开始降低；胰岛素水平越高，血清网膜素-1水平就越低，即胰岛素敏感性随着血清网膜素-1水平的降低而降低，这与人群研究一致[2-3]。当血清网膜素-1水平降低时，提示高血糖状态或高胰岛素水平已经维持了相当长的时间，推测血清网膜素-1水平降低可能成为IR、糖尿病及心血管疾病的早期提示因子。由于2型糖尿病患者早期可能没有明显的不适感觉，因此检测网膜素-1水平，以期为早期诊断及临床治疗提供新思路。但也有相关研究认为大鼠血清网膜素-1与胰岛素抵抗呈正相关[8]，该实验同样采取高脂饲料喂养，但可能由于高脂饲养配方不同、大鼠周龄不同、体重不同或实验误差等原因出现结果的差异，因此需要更多的研究和探讨。

综上所述，血清网膜素-1作为目前已知的4个可增加胰岛素敏感性的“有益”脂肪因子(脂联素、内脂素、vaspin和网膜素)之一[9]，可能通过调节代谢、改善胰岛素抵抗、发挥抗炎作用及保护血管内皮功能等机制参与肥胖、糖尿病、心脑血管疾病的发生与发展。网膜素-1在体内调控及细胞内信号传导机制尚未完全阐明，深入研究其生物学功能及其机制，可为肥胖、糖尿病、心血管疾病及其并发症等提供新的早期诊断指标。

[1] Yang RZ, Lee MJ, Hu H, et al. Identification of omentin as a novel depot-specific adipokine in human adipose tissue: possible role in modulating insulin action[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2006, 290(6):E1253-E1261．

[2] Tan Bk, Adya R, Farhatullah S, et al. Omemin-1, a novel adipokine, is decreased in overweight insulin-resistant women with polycystie ovary syndrome：exvivoandinvivoregulation of omentin-1 by insulin and glucose[J]. Diabetes, 2008, 57(4):801- 808．

[3] Tan BK, Pua S, Syed F, et al. Decreased plasma omentin-1 levels in type 1 diabetes mellitug[J]. Diabet Med, 2008, 25(10):1254-1255．

[4] Moreno-Navarrete JM, Ortega F, Castro A, et al. Circulating omentin as a novel biomarker of endothelial dysfunction[J]. Obesity, 2011, 19(8):1552-1559.

[5] 李兰芳,郭 玉,唐国涛,等.高脂饮食导致大鼠肝脏胰岛素抵抗的作用机制研究[J].中国病理生理杂志,2011,27(2):310-314.

[6] Akbarzadeh S, Ghasemi S, Kalantarhormozi M, et al. Relationship among plasma adipokines, insulin and androgens level as well as biochemical glycemic and lipidemic markers with incidence of PCOS in women with normal BMI[J]. Gynecol Endocrinol, 2012, 28(7):521-524.

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[8] 吕攀攀，瞿 平，毕 杨，等. 高脂饲料诱导的肥胖大鼠网膜素水平的实验研究[J]. 生命科学研究，2012, 16(2):144-148.

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Correlation of serum omentin-1 level and insulin resistance in rats

WANG Nan-nan1, ZHAO Xiao-juan1, CHEN Wei1, BAI Shu-ting1, YANG Bo-wen2

(1DepartmentofEndocrinology,2DepartmentofEpidemic,TheFirstHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:zhaoxiaojuan@medmail.com.cn)

AIM: To establish the insulin resistance rat model for evaluating the correlation of omentin-1 level and insulin resistance. METHODS: SPF male Wistar rats (n=30) were randomly divided into normal control group (NC,n=15) and high-fat diet group (HF,n=15). The rats in NC group were fed with basic diet. The insulin resistant model was established by feeding the rats with high-fat diet in HF group. After 10 weeks, 5 rats in each group were assessed by the technique of hyperinsulinaemic-euglycaemic clamp. After the insulin resistant model was successfully established, the body weight and fasting blood glucose were detected. The concentration of fasting serum omentin-1 was analyzed by ELISA. Fasting serum insulin was measured by radioimmunoassay. RESULTS: No difference of fasting blood glucose between the 2 groups was observed. The level of fasting serum insulin in HF group was significantly higher than that in NC group (P<0.05). The level of serum omentin-1 in HF group were significantly decreased compared with NC group (P<0.01). Pearson’s correlation analysis showed that negative correlations between serum omentin-1 and fasting serum insulin (r=-0.654，P<0.01), serum omentin-1 and free fatty acid (r=-0.446，P<0.05) was found. CONCLUSION: In rats, serum omentin-1 level began to decrease at insulin resistance stage. As serum omentin-1 level decreased, the basal insulin level increased, indicating that decreased serum omentin-1 level may be an early factor of IR, diabetes and cardiovascular diseases.

Insulin resistance; Hyperinsulinaemic-euglycaemic clamp; Omentin-1

1000- 4718(2014)12- 2276- 04

2014- 05- 26

2014- 10- 31

辽宁省科学技术计划资助项目(No. 2009225010-10)

R587

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.029

△通讯作者 Tel: 024-83283135; E-mail: zhaoxiaojuan@medmail.com.cn