恒河猴p53基因沉默靶点在细胞水平的验证

苏静芬，张 晨，李雨函，刘先菊，佟 巍，向志光，石 亮，石桂英，刘云波

(1. 中国医学科学院医学实验动物研究所,北京 100021；2.北京大学生命科学学院 100871)

研究报告

恒河猴p53基因沉默靶点在细胞水平的验证

苏静芬1，张 晨2，李雨函1，刘先菊1，佟 巍1，向志光1，石 亮1，石桂英1，刘云波1

(1. 中国医学科学院医学实验动物研究所,北京 100021；2.北京大学生命科学学院 100871)

目的 为建立恒河猴p53基因沉默模型，首先在细胞水平筛选和测定恒河猴p53基因有效沉默靶点。方法 测定非洲绿猴肾来源成纤维细胞COS-7中p53基因的表达水平；对恒河猴p53 基因做生物信息学分析，优选靶序列设计shRNA，克隆入慢病毒载体FUGW-TDT，转染COS-7细胞，以real-time PCR检测p53 mRNA抑制水平，以 Western blot 检测 p53蛋白水平表达变化。结果 在COS-7细胞检测到p53基因的表达；生物信息学筛选到3个靶片段，分别位于p53 mRNA的238～258 bp,681～701 bp,169～189bp，均在开放阅读框内； p53三个靶位点的沉默效率在mRNA水平分别为(87.17±4.03)%，(72.62±4.11)%，(76.22±0.98)%；在蛋白水平的沉默效率分别为(84.44±2.18)%，(71.04±1.18)%，(74.17±0.95)%。结论 在细胞水平筛选得到3个有效的p53基因沉默靶点，可用于后续的恒河猴基因沉默研究。

基因沉默；p53 基因；恒河猴

啮齿类动物与人类亲缘关系较远，物种间的种属差异使得啮齿类动物的肿瘤模型在应用中受到诸多因素的限制[1]。恒河猴等非人灵长类动物在亲缘关系上和人最接近，因此建立肿瘤的非人灵长类动物模型对于相关疾病的研究具有重要的意义。

恒河猴等非人灵长类动物存在一定的自发肿瘤，以消化系统肿瘤为多[2]，但肿瘤发生率，尤其是肌肉骨骼和呼吸系统肿瘤发生率较低[3]，因此较难使用恒河猴的自发肿瘤来建立动物肿瘤模型。随着转基因等技术在非人灵长类动物的操作成功[4]，通过基因修饰来改变恒河猴等非人灵长类动物的肿瘤易感性，从而最终建立有效的肿瘤动物模型已经成为一个热点领域。

p53基因是十分重要的抑癌基因，p53基因缺失或基因突变在肿瘤的发病机制中起到重要的作用。在原发性肿瘤中p53突变发生率近50%[5]。在恒河猴等非人灵长类动物抑制p53基因的表达水平有可能提高其肿瘤发生率，从而建立可用的肿瘤模型。基于RNA干扰技术的日臻成熟，而p53异常与肿瘤的发生关系密切，为建立恒河猴p53基因沉默模型，本文将首先在细胞水平筛选和测定恒河猴p53基因有效沉默靶点。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

COS-7细胞来自中国医学科学院基础研究所细胞中心，Vero, Vero-E6细胞来自ATCC细胞库。细胞所用培养液为DMEM(Hyclone),含10%胎牛血清(Gibco)。在含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。

1 .2 p53-RNA干扰慢病毒载体的构建

慢病毒载体FUGW-TDT含有ubiquitin promoter(Ubi promoter)调控的红色荧光蛋白tandem dimer Tomato(tdt)报告基因，与U6启动子调控的RNA干扰片段共表达。

根据恒河猴p53基因的序列，依照shRNA的设计原则和Life Technology在线设计工具，选择了3个靶点设计了shRNA序列。将目的片段连至经Xho I和Xba I双酶切后的线性化慢病毒载体FUGW-TDT中，转化E.coliDH5α感受态细胞(全式金公司)，挑单菌落培养后进行菌液鉴定及测序(菌液PCR及测序引物均为F:5’-AGGAAGATGGCT GTGAGG-3’;R:5’-GCCTTGTATCGTATAAGC-3’)，挑取阳性克隆菌液进行质粒抽提并且命名为FUGW-TDT-shP53,本实验的阴性对照为不含shRNA 的FUGW-TDT空质粒。

1.3 慢病毒质粒转染细胞

第1天在六孔板中按(6～8)×105细胞/孔接种细胞，第2天细胞密度达60%～80%时进行转染。本实验所用转染试剂为polyethylenimine(Polysciences)，简称PEI。按质粒：PEI=1:3的比例配制转染混合物，震荡混匀静置30 min后滴入六孔板中，避免震荡。每个质粒做3个复孔。48 h后观察荧光并进行流式分选。

1.4 用荧光激活细胞分选仪(FACS)分选红色荧光细胞

收取转染48 h后细胞，PBS洗3遍，离心去除上清液，用200 μL PBS 重悬，用200目尼龙膜过滤后，上机(BD,Aria I)分选。

1.5 普通PCR和SYBR-Green法实时荧光定量PCR

按照Invitrogen Trizol Reagent说明书抽提细胞总的RNA，逆转录及PCR反应按照试剂盒说明书操作。p53基因所用引物为F:5’- CCCTTCCCAGA AAACCTACC-3’, R:5’-CTCCGTCATGTGCTGTGAC T-3’ 预计扩增出223 bp左右的目的片段。内参GAPDH的引物选自文献[6]，F:5’-ACATCATCCCT GCCTCTACTGG-3’，R:5’-AGTGGGTGTCGCTTTGA AGTC-3’，预计扩增出261bp左右的目的片段。PCR反应程序：94℃预变性2 min，94℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环，72℃延伸10 min。

1.6 Western Blot

将细胞培养液弃掉，用 PBS洗细胞2 次，然后弃掉，加入蛋白裂解液，吹打均匀后吸入1.5 mL EP管，离心弃沉淀，测定浓度。总蛋白上样量为20 μg。取适量上清液与sample buffer 混合。沸水煮变性后离心。SDS-PAGE电泳，转膜加一抗(mouse anti-monkey p53, Santa Cruz)，二抗，然后X-胶片曝光，暗室显影。最后用Image J软件对图像进行灰度扫描分析。

表1 恒河猴p53基因沉默靶点Tab.1 The gene silence sites of rhesus monkey p53

1.7 统计学方法

采用Student’st检验。

2 结果

2.1 生物信息学分析

根据恒河猴p53基因序列，依照shRNA的设计原则和Life Technology 网站(http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/setOption.do?design Option=shrna&pid=261946071111563135)选择了3个靶点设计了shRNA序列，具体序列和在恒河猴p53 mRNA中的位置见表1。3个靶点均与非洲绿猴p53基因100%同源。

2.2 p53-RNA干扰慢病毒载体构建

首先将针对靶位点的21 nt寡核苷酸的以正反向组合，中间添加loop环结构(序列为CTCAAGAGA)，使寡核苷酸可以形成发夹结构。另添加转录终止子TTTTTT。并且在正义链模板的5’端添加XhoI酶切位点，在反义链模板的5’端添加XbaI酶切位点。由此合成靶序列的oligoDNA(图1A)。之后将oligoDNA连接在U6启动子的下游，成功构建FUGW-TDT-p53shRNA载体(图1B)。

注:A: 针对恒河猴p53的特异的shRNA-1的 双链寡核苷酸DNA序列的正义链； B：FUGW-TDT-shp53慢病毒载体图1 结构示意图Fig.1 The frame of FUGW-TDT-shp53

2.3 p53 细胞丰度检测

我们选取了COS-7、Vero、Vero-E6三种细胞检测p53丰度，提取RNA后逆转录为cDNA,普通PCR后电泳(图2)。结果显示三种细胞p53的丰度均较高，我们选取COS-7用于基因抑制效率检测。

注：图示为p53在COS-7，Vero, Vero-E6 三种细胞的丰度。H2O为阴性对照。图2 p53 细胞丰度检测Note. There is the abundance of three types of cells: COS-7，Vero, and Vero-E6 cells. H2O is the negative control.Fig.2 Detection of the p53 abundance

2.4 p53 mRNA 水平沉默效率检测

为了确定3个shRNA质粒的沉默效率，在转染48 h之后，trizol法分别抽提RNA,逆转录后进行real-time PCR，按2-ΔΔCt法进行计算。如图3所示，与对照FUGW-TDT相比，3个shRNA对应的P53 基因mRNA表达量均明显降低(P<0.05)。其中FUGW-TDT- shp53-1的沉默效率为(87.17±4.03)%，FUGW-TDT- shp53-2的沉默效率为(72.62±4.11)%，FUGW-TDT- shp53-3的沉默效率为(76.22±0.98)%。三个靶位点在p53 mRNA 水平的沉默效率均很明显。

注：1:对照组FUGW-TDT；2:FUGW-TDT-shp53-1； 3: FUGW-TDT-shp53-2；4: FUGW-TDT- shp53-3； n=3,*代表P<0.05 vs对照组FUGW-TDT图3 SYBR-Green法Real-time PCR 检测p53 基因mRNA的表达Note.1. Control group FUGW-TDT; 2. FUGW-TDT-shp53-1; 3: FUGW-TDT-shp53-2; 4: FUGW-TDT-shp53-3; n=3,*means P<0.05 vs. control group FUGW-TDT.Fig.3 Detection of p53 mRNA by real-time PCR

注:图A:Western Blot图 B:灰度扫描图像分析结果图4 Western Blot检测p53 蛋白的表达1:FUGW-TDT-shp53-1；2: FUGW-TDT-shp53-2； 3: FUGW-TDT-shp53-3；4:FUGW-TDT； n=3,*表示P<0.05 vs. 对照组FUGW-TDTFig.4 Detection of p53 protein by Western blot

2.5 p53 蛋白水平沉默效率检测

Western Blot检测p53 基因蛋白的表达,结果表明转染了p53shRNA的细胞，蛋白表达量明显低于转染了FUGW-TDT的对照组(图4 A)。其中FUGW-TDT-shp53-1的沉默效率为(84.44±2.18)%，FUGW-TDT-shp53-2的沉默效率为(71.04±1.18)%，FUGW-TDT-shp53-3的沉默效率为(74.17±0.95)%(图4 B)。三个靶位点在p53蛋白水平的沉默效率均很明显。Western Blot的结果和real-time PCR保持一致。

3 讨论

p53基因是人类研究的最多的抑癌基因。据文献报道，p53+/-,p53-/-高度肿瘤易感, 早期自发成瘤，而以淋巴瘤和肉瘤占主体。p53mutant /+,p53mutant /-上皮组织来源的瘤比例大幅提高，肿瘤转移率较高[7,8]。但目前还没有利用p53基因沉默来诱发肿瘤的报道，更没有人在非人灵长类上利用p53基因沉默来诱发肿瘤的报道。为建立恒河猴p53基因沉默诱导的肿瘤模型，首先在细胞水平筛选和测定恒河猴p53基因有效沉默靶点。本实验利用RNA干扰技术在COS-7细胞中实现了p53基因沉默。通过设计针对非人灵长类p53基因的干扰序列，构建FUGW-TDT-shRNA载体，转染COS-7细胞。实时荧光定量PCR和Western Blot分析RNA干扰的COS-7细胞中p53 mRNA水平和蛋白表达量均比对照组显著降低。Western Blot和实时荧光定量PCR结果完全吻合，说明这三个p53 沉默位点都是有效的，均适合用于后续的恒河猴胚胎和个体水平上的实验。可以进行病毒包装后在恒河猴胚胎和个体水平继续验证，以期建立非人灵长类动物肿瘤模型。

质粒的转染效率对实验结果影响很大。原本具有沉默效率的靶点可能因为转染效率较低而无法在mRNA和蛋白水平显示，呈假阴性。为此可采用药物筛选得到稳定转染细胞系，也可瞬时转染后流式分选转染成功的细胞。本实验采用了流式细胞仪分选红色荧光细胞，从而使三个靶位点在mRNA和蛋白水平的沉默效率得以充分显示。

致谢：感谢中国医学科学院医学实验动物研究所的张连峰教授，宋铭晶副教授在实验思路上的指导，感谢张丽芳老师、常慧老师在实验方法上的帮助，感谢同学马元武、修晶辉、鲍丹、陈巍、隋小龙、马婧及北京大学生命科学学院的同学汪霞、贾漠野在具体实验操作或数据分析整理上的帮助。

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Rhesus monkey P53 gene silencing at the cellular level

SU Jing-fen1, ZHANG Chen2,LI Yu-han1, LIU Xian-ju1, TONG Wei1, XIANG Zhi-guang1,SHI Liang1,SHI Gui-ying1,LIU Yun-bo1

(1. Institude of Medical Laboratory Animal Science,Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China;2.College of Life Science, Peking University, Beijing 100871)

Objective In order to establish a rhesus monkey model of p53 gene silencing, firstly we screened and determined the effective silencing targets of p53 gene at the cellular level in rhesus monkey.Methods The expression of p53 gene was detected in COS-7 cells (derived from the kidney of the African Green Monkey,Cercopithecusaethiops).Three small hairpin RNA (shRNA) sequences targeting rhesus monkey p53 gene were designed, analysed by bioinformatics, and inserted into lentivirus-based gene silencing constructs FUGW-TDT. The plasmids of p53-RNAi and control vector were transfected into the COS-7 cells, respectively.The suppression of p53 mRNA was detected by real-time PCR, and the changes of p53 protein expression were detected by Western blot assay. Results p53 gene expression was detected in COS-7 cells.Bioinformatics analysis showed that three gene-silencing sequences were screened which lied in the open reading frame (ORF) region and targeted 238-258bp, 681-701bp, 169-189bp of the rhesus monkey p53 mRNA.At 48 hrs after transfection of the three silencing constructs, p53 mRNA was suppressed by(87.17±4.03)%, (72.62±4.11)% and(76.22±0.98)%, and p53 protein was suppressed by (84.44±2.18)%, (71.04±1.18)% and (74.17±0.95)%, respectively. Conclusions We obtained three effective target sequences showing high efficiency in p53silencing, which can be used in further studies on gene silencing in rhesus monkey.

Gene silence; p53 gene; Rhesus monkey

国家科技支撑计划(No.2014BAI03B01)。

苏静芬(1987- )，女，硕士研究生,研究方向：实验动物学。E-mail: jingfensu@126.com。

刘云波，E-mail: yunboliu@126.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0007-04

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.002

2014-06-20