新城疫病毒LaSota株的毒株复壮鉴定试验

戴建华+马晨辉+王永娟

摘要：将冻存已久的新城疫病毒LaSota株在鸡胚中连传5代，获得E1～E5代病毒，选取代表性的E1和E5病毒进行病毒生物学与免疫原性鉴定。通过透射电镜法观察病毒粒子形态，利用血凝试验测定病毒的血凝价，借助1日龄雏鸡脑内注射的致病指数、最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间、鸡胚致病率、鸡胚半数感染量等指标判定病毒的毒力或致病率，以雏鸡免疫试验确定病毒的安全性与免疫原性。结果表明，引入的LaSota株经过复壮，无论从形态还是从生化特性、免疫学特性方面，均符合低毒力活疫苗株的要求，可以用作单联苗或多联苗的制备。

关键词：新城疫；LaSota株；复壮；鉴定

中图分类号： S858.315.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0164-02

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的禽类急性致死性传染病，传播速度快，长期以来对我国的养禽业构成了巨大威胁[1-5]。为了防治新城疫，除应用严格的生物安全措施、防止新城疫病毒强毒进入禽群外，疫苗免疫是必不可少的手段。在我国，使用低毒力活疫苗和油乳剂灭活苗已成为大多数禽场防制新城疫的常规手段[6]。新城疫病毒LaSota株是我国普遍使用的疫苗株，本试验复壮的毒株是1986年从英国中央兽医实验室引进的由中国农业科学院上海兽医研究所保存的冻干毒，作为疫苗毒种，笔者对其生物学和免疫学特性进行了系统鉴定，现将有关试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

新城疫病毒LaSota株由中国农业科学院上海兽医研究所提供；新城疫病毒标准株F48E8购自中国兽医药品监察所；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；SPF鸡购自山东省农业科学院SPF鸡场。

1.2 LaSota毒株的复壮与传代

对保存的冻干毒以生理盐水稀释100倍后，接种 0.1 mL 于10日龄SPF鸡胚，收集24 h后死亡鸡胚尿囊液为E0代毒，后将E0代毒按同样方法在10日龄SPF鸡胚中续传5次得到E1至E5代病毒。

1.3 形态学观察

收集E5代病毒尿囊液，15 000 r/min离心60 min，取沉淀悬液滴于有支持膜的铜网上，10 min后用干净滤纸从网边吸去液体，另滴加3%磷钨酸（pH值6.0）染色2～3 min，之后吸去液体立即进行透射电镜观察。

1.4 病毒血凝试验

参考文献[7]的方法，用微量法在V型反应板上测定 E0至E5 代病毒的血凝价。

1.5 病毒毒力测定

参考文献[8]的方法，测定新城疫病毒E1代和E5代病毒的1日龄雏鸡脑内注射的致病指数（ICPI）与最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间（MDT）。鸡或鸡胚的样本数均为10。

1.6 病毒EID50测定

参考文献[9]的方法，对E1代和E5代病毒用灭菌生理盐水作10倍梯度稀释，各取0.1 mL 10-7、10-8、10-9 3个稀释度病毒液尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，弃去48 h前死亡的鸡胚，随时取出48～120 h死亡的鸡胚，2～8 ℃冷却后收获尿囊液，同一稀释度的尿囊液等量混合，分别测定红细胞凝集价，至120 h取出所有活胚，逐个收获尿囊液，分别测定红细胞凝集价，红细胞凝集价≥1 ∶ 128者判为感染，计算鸡胚半数感染量（EID50）。

1.7 鸡胚致病率测定

取E1代和E5代病毒，用灭菌生理盐水稀释100倍，按照每胚0.1 mL剂量尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10个，置 37 ℃ 继续孵育，记录24～120 h内死亡鸡胚数和胎儿病变。

1.8 安全性测定

将20羽5日龄SPF雏鸡随机分为2组，每组10羽。其中一组用滴鼻法[8]接种0.05 mL 5倍浓缩的含毒尿囊液，另一组作空白对照。相同条件下隔离饲养10 d，每天记录鸡群情况。

1.9 免疫原性测定

取病毒含量不同的E1代和E5代病毒，经0.1%甲醛灭活，按LaSota灭活苗质量起草说明书方法制备成单苗，按 10 000 EID50、5 000 EID50、1 000 EID50、500 EID50的剂量免疫7日龄SPF雏鸡，每个剂量10羽。28日龄时用100 000 EID50的F48E8强毒株攻击，120 h内记录死亡率和疫苗的保护率。

2 结果与分析

2.1 形态学检测结果

通过透射电镜观察复壮后的新城疫病毒粒子，结果显示新城疫病毒粒子呈圆形或椭圆形，直径100～500 nm，外周有囊膜，囊膜上有长约10 nm的纤突（图1）。

3 结论与讨论

透射电镜观察结果显示，病毒粒子具有明显的新城疫病毒特征，说明病毒存在，并初步认为毒株正确。引进的LaSota株经复壮后能在鸡胚良好繁殖，在鸡胚中连传5代，鸡胚尿囊液中血凝滴度均达29以上，说明毒株是稳定的。从对该毒株系统鉴定的结果看，其红细胞凝集价、1日龄雏鸡脑内注射的致病指数（ICPI）、最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间（MDT）、对鸡胚毒力、安全性、免疫原性等都符合新城疫低毒力活疫苗株的要求。

上述系统的鉴定试验证明，引入的LaSota株经过复壮，无论从形态还是从生化特性、免疫学特性方面均符合低毒力活疫苗株的要求，可以用作单联苗或多联苗的制备。

参考文献：

[1]童光志. 动物传染病学[M]. 北京：中国农业出版社，2005.

[2]梁淑珍，郭 兵，王海风. 中药复方对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响[J]. 江苏农业科学，2012，40（2）：176-178.

[3]段志强，胡 娇，胡增垒，等. 鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备[J]. 江苏农业学报，2012，28（1）：125-130.

[4]魏 宁，桂文龙，李巨银，等. 新城疫疫苗及免疫程序对蛋鸡免疫效果的研究[J]. 江苏农业科学，2012，40（11）：232-234.

[5]于 洋，封 振，何孔旺，等. 新城疫病毒毒力分子机制研究进展[J]. 江苏农业学报，2013，29（2）：435-439.

[6]杨 煦，刘玉芬，刘怀然. 新城疫疫苗的研究进展[J]. 现代农业科技，2012，2（2）：325-327.

[7]Saif Y M. 禽病学[M]. 苏敬良，高福，索勋主，译. 11版. 北京：中国农业出版社，2005：711-733.

摘要：将冻存已久的新城疫病毒LaSota株在鸡胚中连传5代，获得E1～E5代病毒，选取代表性的E1和E5病毒进行病毒生物学与免疫原性鉴定。通过透射电镜法观察病毒粒子形态，利用血凝试验测定病毒的血凝价，借助1日龄雏鸡脑内注射的致病指数、最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间、鸡胚致病率、鸡胚半数感染量等指标判定病毒的毒力或致病率，以雏鸡免疫试验确定病毒的安全性与免疫原性。结果表明，引入的LaSota株经过复壮，无论从形态还是从生化特性、免疫学特性方面，均符合低毒力活疫苗株的要求，可以用作单联苗或多联苗的制备。

关键词：新城疫；LaSota株；复壮；鉴定

中图分类号： S858.315.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0164-02

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的禽类急性致死性传染病，传播速度快，长期以来对我国的养禽业构成了巨大威胁[1-5]。为了防治新城疫，除应用严格的生物安全措施、防止新城疫病毒强毒进入禽群外，疫苗免疫是必不可少的手段。在我国，使用低毒力活疫苗和油乳剂灭活苗已成为大多数禽场防制新城疫的常规手段[6]。新城疫病毒LaSota株是我国普遍使用的疫苗株，本试验复壮的毒株是1986年从英国中央兽医实验室引进的由中国农业科学院上海兽医研究所保存的冻干毒，作为疫苗毒种，笔者对其生物学和免疫学特性进行了系统鉴定，现将有关试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

新城疫病毒LaSota株由中国农业科学院上海兽医研究所提供；新城疫病毒标准株F48E8购自中国兽医药品监察所；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；SPF鸡购自山东省农业科学院SPF鸡场。

1.2 LaSota毒株的复壮与传代

对保存的冻干毒以生理盐水稀释100倍后，接种 0.1 mL 于10日龄SPF鸡胚，收集24 h后死亡鸡胚尿囊液为E0代毒，后将E0代毒按同样方法在10日龄SPF鸡胚中续传5次得到E1至E5代病毒。

1.3 形态学观察

收集E5代病毒尿囊液，15 000 r/min离心60 min，取沉淀悬液滴于有支持膜的铜网上，10 min后用干净滤纸从网边吸去液体，另滴加3%磷钨酸（pH值6.0）染色2～3 min，之后吸去液体立即进行透射电镜观察。

1.4 病毒血凝试验

参考文献[7]的方法，用微量法在V型反应板上测定 E0至E5 代病毒的血凝价。

1.5 病毒毒力测定

参考文献[8]的方法，测定新城疫病毒E1代和E5代病毒的1日龄雏鸡脑内注射的致病指数（ICPI）与最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间（MDT）。鸡或鸡胚的样本数均为10。

1.6 病毒EID50测定

参考文献[9]的方法，对E1代和E5代病毒用灭菌生理盐水作10倍梯度稀释，各取0.1 mL 10-7、10-8、10-9 3个稀释度病毒液尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，弃去48 h前死亡的鸡胚，随时取出48～120 h死亡的鸡胚，2～8 ℃冷却后收获尿囊液，同一稀释度的尿囊液等量混合，分别测定红细胞凝集价，至120 h取出所有活胚，逐个收获尿囊液，分别测定红细胞凝集价，红细胞凝集价≥1 ∶ 128者判为感染，计算鸡胚半数感染量（EID50）。

1.7 鸡胚致病率测定

取E1代和E5代病毒，用灭菌生理盐水稀释100倍，按照每胚0.1 mL剂量尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10个，置 37 ℃ 继续孵育，记录24～120 h内死亡鸡胚数和胎儿病变。

1.8 安全性测定

将20羽5日龄SPF雏鸡随机分为2组，每组10羽。其中一组用滴鼻法[8]接种0.05 mL 5倍浓缩的含毒尿囊液，另一组作空白对照。相同条件下隔离饲养10 d，每天记录鸡群情况。

1.9 免疫原性测定

取病毒含量不同的E1代和E5代病毒，经0.1%甲醛灭活，按LaSota灭活苗质量起草说明书方法制备成单苗，按 10 000 EID50、5 000 EID50、1 000 EID50、500 EID50的剂量免疫7日龄SPF雏鸡，每个剂量10羽。28日龄时用100 000 EID50的F48E8强毒株攻击，120 h内记录死亡率和疫苗的保护率。

2 结果与分析

2.1 形态学检测结果

通过透射电镜观察复壮后的新城疫病毒粒子，结果显示新城疫病毒粒子呈圆形或椭圆形，直径100～500 nm，外周有囊膜，囊膜上有长约10 nm的纤突（图1）。

3 结论与讨论

透射电镜观察结果显示，病毒粒子具有明显的新城疫病毒特征，说明病毒存在，并初步认为毒株正确。引进的LaSota株经复壮后能在鸡胚良好繁殖，在鸡胚中连传5代，鸡胚尿囊液中血凝滴度均达29以上，说明毒株是稳定的。从对该毒株系统鉴定的结果看，其红细胞凝集价、1日龄雏鸡脑内注射的致病指数（ICPI）、最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间（MDT）、对鸡胚毒力、安全性、免疫原性等都符合新城疫低毒力活疫苗株的要求。

上述系统的鉴定试验证明，引入的LaSota株经过复壮，无论从形态还是从生化特性、免疫学特性方面均符合低毒力活疫苗株的要求，可以用作单联苗或多联苗的制备。

参考文献：

[1]童光志. 动物传染病学[M]. 北京：中国农业出版社，2005.

[2]梁淑珍，郭 兵，王海风. 中药复方对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响[J]. 江苏农业科学，2012，40（2）：176-178.

[3]段志强，胡 娇，胡增垒，等. 鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备[J]. 江苏农业学报，2012，28（1）：125-130.

[4]魏 宁，桂文龙，李巨银，等. 新城疫疫苗及免疫程序对蛋鸡免疫效果的研究[J]. 江苏农业科学，2012，40（11）：232-234.

[5]于 洋，封 振，何孔旺，等. 新城疫病毒毒力分子机制研究进展[J]. 江苏农业学报，2013，29（2）：435-439.

[6]杨 煦，刘玉芬，刘怀然. 新城疫疫苗的研究进展[J]. 现代农业科技，2012，2（2）：325-327.

[7]Saif Y M. 禽病学[M]. 苏敬良，高福，索勋主，译. 11版. 北京：中国农业出版社，2005：711-733.

摘要：将冻存已久的新城疫病毒LaSota株在鸡胚中连传5代，获得E1～E5代病毒，选取代表性的E1和E5病毒进行病毒生物学与免疫原性鉴定。通过透射电镜法观察病毒粒子形态，利用血凝试验测定病毒的血凝价，借助1日龄雏鸡脑内注射的致病指数、最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间、鸡胚致病率、鸡胚半数感染量等指标判定病毒的毒力或致病率，以雏鸡免疫试验确定病毒的安全性与免疫原性。结果表明，引入的LaSota株经过复壮，无论从形态还是从生化特性、免疫学特性方面，均符合低毒力活疫苗株的要求，可以用作单联苗或多联苗的制备。

关键词：新城疫；LaSota株；复壮；鉴定

中图分类号： S858.315.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0164-02

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的禽类急性致死性传染病，传播速度快，长期以来对我国的养禽业构成了巨大威胁[1-5]。为了防治新城疫，除应用严格的生物安全措施、防止新城疫病毒强毒进入禽群外，疫苗免疫是必不可少的手段。在我国，使用低毒力活疫苗和油乳剂灭活苗已成为大多数禽场防制新城疫的常规手段[6]。新城疫病毒LaSota株是我国普遍使用的疫苗株，本试验复壮的毒株是1986年从英国中央兽医实验室引进的由中国农业科学院上海兽医研究所保存的冻干毒，作为疫苗毒种，笔者对其生物学和免疫学特性进行了系统鉴定，现将有关试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

新城疫病毒LaSota株由中国农业科学院上海兽医研究所提供；新城疫病毒标准株F48E8购自中国兽医药品监察所；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；SPF鸡购自山东省农业科学院SPF鸡场。

1.2 LaSota毒株的复壮与传代

对保存的冻干毒以生理盐水稀释100倍后，接种 0.1 mL 于10日龄SPF鸡胚，收集24 h后死亡鸡胚尿囊液为E0代毒，后将E0代毒按同样方法在10日龄SPF鸡胚中续传5次得到E1至E5代病毒。

1.3 形态学观察

收集E5代病毒尿囊液，15 000 r/min离心60 min，取沉淀悬液滴于有支持膜的铜网上，10 min后用干净滤纸从网边吸去液体，另滴加3%磷钨酸（pH值6.0）染色2～3 min，之后吸去液体立即进行透射电镜观察。

1.4 病毒血凝试验

参考文献[7]的方法，用微量法在V型反应板上测定 E0至E5 代病毒的血凝价。

1.5 病毒毒力测定

参考文献[8]的方法，测定新城疫病毒E1代和E5代病毒的1日龄雏鸡脑内注射的致病指数（ICPI）与最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间（MDT）。鸡或鸡胚的样本数均为10。

1.6 病毒EID50测定

参考文献[9]的方法，对E1代和E5代病毒用灭菌生理盐水作10倍梯度稀释，各取0.1 mL 10-7、10-8、10-9 3个稀释度病毒液尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，弃去48 h前死亡的鸡胚，随时取出48～120 h死亡的鸡胚，2～8 ℃冷却后收获尿囊液，同一稀释度的尿囊液等量混合，分别测定红细胞凝集价，至120 h取出所有活胚，逐个收获尿囊液，分别测定红细胞凝集价，红细胞凝集价≥1 ∶ 128者判为感染，计算鸡胚半数感染量（EID50）。

1.7 鸡胚致病率测定

取E1代和E5代病毒，用灭菌生理盐水稀释100倍，按照每胚0.1 mL剂量尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10个，置 37 ℃ 继续孵育，记录24～120 h内死亡鸡胚数和胎儿病变。

1.8 安全性测定

将20羽5日龄SPF雏鸡随机分为2组，每组10羽。其中一组用滴鼻法[8]接种0.05 mL 5倍浓缩的含毒尿囊液，另一组作空白对照。相同条件下隔离饲养10 d，每天记录鸡群情况。

1.9 免疫原性测定

取病毒含量不同的E1代和E5代病毒，经0.1%甲醛灭活，按LaSota灭活苗质量起草说明书方法制备成单苗，按 10 000 EID50、5 000 EID50、1 000 EID50、500 EID50的剂量免疫7日龄SPF雏鸡，每个剂量10羽。28日龄时用100 000 EID50的F48E8强毒株攻击，120 h内记录死亡率和疫苗的保护率。

2 结果与分析

2.1 形态学检测结果

通过透射电镜观察复壮后的新城疫病毒粒子，结果显示新城疫病毒粒子呈圆形或椭圆形，直径100～500 nm，外周有囊膜，囊膜上有长约10 nm的纤突（图1）。

3 结论与讨论

透射电镜观察结果显示，病毒粒子具有明显的新城疫病毒特征，说明病毒存在，并初步认为毒株正确。引进的LaSota株经复壮后能在鸡胚良好繁殖，在鸡胚中连传5代，鸡胚尿囊液中血凝滴度均达29以上，说明毒株是稳定的。从对该毒株系统鉴定的结果看，其红细胞凝集价、1日龄雏鸡脑内注射的致病指数（ICPI）、最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间（MDT）、对鸡胚毒力、安全性、免疫原性等都符合新城疫低毒力活疫苗株的要求。

上述系统的鉴定试验证明，引入的LaSota株经过复壮，无论从形态还是从生化特性、免疫学特性方面均符合低毒力活疫苗株的要求，可以用作单联苗或多联苗的制备。

参考文献：

[1]童光志. 动物传染病学[M]. 北京：中国农业出版社，2005.

[2]梁淑珍，郭 兵，王海风. 中药复方对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响[J]. 江苏农业科学，2012，40（2）：176-178.

[3]段志强，胡 娇，胡增垒，等. 鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备[J]. 江苏农业学报，2012，28（1）：125-130.

[4]魏 宁，桂文龙，李巨银，等. 新城疫疫苗及免疫程序对蛋鸡免疫效果的研究[J]. 江苏农业科学，2012，40（11）：232-234.

[5]于 洋，封 振，何孔旺，等. 新城疫病毒毒力分子机制研究进展[J]. 江苏农业学报，2013，29（2）：435-439.

[6]杨 煦，刘玉芬，刘怀然. 新城疫疫苗的研究进展[J]. 现代农业科技，2012，2（2）：325-327.

[7]Saif Y M. 禽病学[M]. 苏敬良，高福，索勋主，译. 11版. 北京：中国农业出版社，2005：711-733.