不同直径卵泡对绵羊卵母细胞体外发育能力的影响

2014-07-16张利等

江苏农业科学 2014年3期

张利等

摘要：以屠宰场绵羊卵巢为材料，采用抽吸法收集小卵泡、中卵泡、大卵泡卵母细胞，研究不同卵泡直径对卵母细胞回收效果、比例分布以及对卵母细胞直径、谷胱甘肽（GSH）含量和体外发育能力的影响。结果表明，3种卵泡卵母细胞比例分布差异极显著（P<0.01）；3种卵泡卵母细胞的回收率无显著差异（P>0.05），但中、大卵泡卵母细胞可用率极显著高于小卵泡卵母细胞（P<0.01）；小卵泡卵母细胞的直径极显著小于中、大卵泡卵母细胞（P<0.01）；中、大卵泡卵母细胞成熟培养24 h后GSH含量显著高于小卵泡卵母细胞（P<0.05）；经孤雌激活体外培养后，中、大卵泡卵母细胞的成熟率分别极显著（P<0.01）、显著（P<0.05）高于小卵泡卵母细胞，中、大卵泡卵母细胞囊胚率极显著高于小卵泡卵母细胞（P<001）；中卵泡卵母细胞囊胚细胞总数显著高于小卵泡卵母细胞（P<0.05），但与大卵泡卵母细胞差异不显著（P>005）。因此，直径≥2 mm的卵泡的卵母细胞适合体外培养和体外胚胎的生产。

关键词：卵泡直径；绵羊；卵母细胞；孤雌激活

中图分类号： S826.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0141-04

随着哺乳动物体外受精、克隆、转基因等生物技术研究的不断深入，对动物卵母细胞的数量、质量要求越来越高。目前，胚胎体外生产（in vitro production，IVP）的卵母细胞主要来源于屠宰场收集的卵巢，由于屠宰动物的年龄及卵巢表面卵泡的大小等存在差异，培养后获得的胚胎质量也有很大差异[1]，一般收集的卵泡卵母细胞囊胚率都很低[2]。与体内自然成熟的卵母细胞相比，体外培养的卵母细胞成熟率、受精率和早期胚胎发育能力呈现不同程度的下降趋势。在体内，卵母细胞在卵泡内发育成熟，作为卵母细胞的生长环境，卵泡的大小对卵母细胞的成熟和后期发育潜力起着至关重要的作用[3]。Crozet等早期报道，不同直径卵泡中的卵母细胞发育能力不同，所以研究卵泡大小对后期发育潜力的影响十分必要[4]。目前，国内外很多研究者只报道了山羊[5-6]、牛[3]的卵泡大小对卵母细胞发育的影响，且国内还未见对绵羊的报道。本研究分析卵泡直径对卵母细胞的回收效果、比例分布以及对卵母细胞直径、谷胱甘肽（GSH）含量和体外发育能力的影响，以期为胚胎工程中卵子的来源和选择提供基础依据，并提高体外生产胚胎的水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品及试剂本研究所用化学试剂除特殊说明外均购自Sigma公司；培养用胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（NEAA）购自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）购自Bovogen公司。

1.1.2 卵巢采集卵巢采集于新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市华凌屠宰场。母羊屠宰后立即剖腹取出卵巢，置于37～38 ℃含青霉素、链霉素（双抗）的生理盐水中，2～3 h内送至实验室；用约38.5 ℃、含有双抗的生理盐水洗涤2～3次，以灭菌的吸水纸吸干后，用带9号针头的吸有1～2 mL抽卵液的10 mL注射器分别抽取<2 mm（小卵泡）、2～5 mm（中卵泡）、>5 mm（大卵泡）的卵泡中的卵泡液；分别在体式镜下挑选出卵丘细胞包裹3层以上、结构致密的卵母细胞-卵丘细胞复合体（cumulus oocyte complexes，COCs），移入抽卵液中洗3次。

1.2 方法

1.2.1 卵母细胞的体外成熟培养将各组卵母细胞分别用抽卵液洗涤3次后，再用体外成熟（in vitro maturation，IVM）液洗涤3次，按20～30枚/滴移入100 μL提前5～6 h平衡好的IVM液滴内，在38.6 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下进行成熟培养。液体配制如下：抽卵液：Hepes-199+2%FBS+ 6 U/mL 肝素钠+100 U/mL双抗；IVM：TCM199+0.05 U/mL FSH+10%FBS+1 μg/mL雌激素+10 ng/mL EGF+0.1 mmol/L半胱胺酸+24.2 mg/mL丙酮酸钠+100 U/mL双抗。

1.2.2 去除卵丘细胞卵母细胞成熟培养22～24 h后，将卵母细胞在含0.1%透明质酸酶的Hepes-199中用吸管反复吹打去除全部卵丘细胞，在体视镜下挑出排出第一极体的卵母细胞用于后期培养，并统计体外培养成熟率。

1.2.3 卵母细胞孤雌激活挑选出有极体且细胞质均匀的卵母细胞在含5 μmol/L离子霉素（ionomycin）的激活液中激活4 min，经2 mmol/L 6-DMAP培养液洗2次后，移入含 6-DMAP 的培养液内培养2 h，培养液洗涤3次后移入含有 600～700 μL 体外培养液的四孔培养板中培养，CO2箱培养条件为38.6 ℃、5%CO2、5%O2、90% N2及饱和湿度，培养 48 h 后统计卵裂率，培养6～8 d统计囊胚率。

1.2.4 囊胚Hoechst细胞染色取7 d的囊胚，将囊胚转移到含10 μg/mL Hoechst33342的抽卵液内避光孵育7～10 min，再将囊胚转移到载玻片上，尽量少带液体，盖上盖玻片，用凡士林封片，在倒置显微镜的紫外光下进行细胞计数。

1.2.5 数据统计数据采用SPSS 13.0统计软件的 One-way ANOVA方法进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同卵泡直径的比例

随机从一批卵巢中抽取约40个卵巢进行样本统计，分成3种卵泡，卵泡直径<2 mm（小卵泡）、2～5 mm（中卵泡）、>5 mm（大卵泡）3组间差异极显著（P<0.01）（表1）。

2.3 不同直径卵泡中卵母细胞直径的比较

抽取不同直径卵泡的卵母细胞，培养24 h后分别脱卵丘后使用尼康（NIS-Element D3.1）系统软件进行直径测定，结果如图1所示，中卵泡和大卵泡卵母细胞的直径差异不显著（P>0.05），但均极显著高于小卵泡卵母细胞的直径（P<001）。endprint

2.4 不同直径卵泡中卵母细胞GSH含量的比较

抽取不同直径卵泡的卵母细胞，培养24 h后分别脱卵丘后进行GSH含量测定（采用江苏碧云天公司生产的GSH和GSSG检测试剂盒），结果如图2所示，随着卵泡直径增大，GSH含量增加，中卵泡和大卵泡卵母细胞的GSH含量差异不显著（P>0.05），但均显著高于小卵泡卵母细胞的GSH含量（P<0.05）。

2.5 卵泡直径对卵母细胞体外培养的影响

为了比较卵泡直径对卵母细胞体外培养效果的影响，将回收的3组卵泡卵母细胞分别成熟培养并孤雌激活，结果如表3所示，小卵泡卵母细胞的成熟率极显著低于中卵泡卵母细胞（P<0.01），也显著低于大卵泡卵母细胞（P<0.05）；3组卵泡卵母细胞卵裂率差异不显著（P>0.05）；小卵泡卵母细胞囊胚率极显著低于中卵泡和大卵泡（P<0.01），后两者之间差异不显著（P>0.05）；中卵泡卵母细胞囊胚细胞总数显著高于小卵泡（P<0.05），与大卵泡差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

3.1 卵泡直径对卵泡比例分布的影响

同一卵巢上的卵泡比例分布还未曾有人报道。绵羊是常见的季节性发情动物，其最主要的发情时间集中在9—12月。由于受日照时间和体内激素水平的影响，在非繁殖季节和繁殖季节，卵巢表面的卵泡大小有所不同。非繁殖季节主要为中、小卵泡，中、大卵泡通常在每个卵巢上最多只有2个[7]。本研究结果表明，同一卵巢表面小卵泡（小于2 mm）占的比例较多，随着卵泡直径增大，中卵泡（2～5 mm）和大卵泡（大于5 mm）占的比例越来越少，小卵泡、中卵泡和大卵泡3组间差异极显著，这可能是因为本试验是在非繁殖季节所统计。

3.2 不同卵泡直径对卵母细胞回收效果的影响

田长永等报道，山羊不同直径卵泡卵母细胞的回收率无差异，但在可用率方面，大卵泡卵母细胞极显著高于小卵泡[6]，本研究结果与该结论一致。随着卵泡直径的增大和体内激素的变化，卵泡腔变大，卵泡液增多，颗粒细胞将卵母细胞包裹得更加紧密[8]。本研究中，随着卵泡增大，回收率和可用率都在增加，仅个别的卵母细胞有退化现象，这与Heighington等的研究结果[9]基本一致，大卵泡的回收率和利用率达到最高，同时也发现小卵泡卵母细胞极易抽成裸卵。究其原因，一是小卵泡的卵泡液较少，卵丘卵母复合体（COCs）和周围的卵巢组织联系比较紧密，大部分颗粒细胞和卵泡相连，在抽吸的过程中易于抽裸，而大卵泡卵泡液较多，仅有一小部分颗粒细胞和卵泡相连，卵母细胞接近游离状态，易于回收；二是大卵泡的卵泡液较多，在抽吸的过程可能会起到一定缓冲作用，减少了针头对COCs的机械损伤，而小卵泡卵泡液较少，损伤程度可能较大，所以大卵泡和中卵泡的可用率明显高于小卵泡。这说明卵泡直径显著影响卵母细胞的回收利用效果。

3.3 不同直径卵泡内卵母细胞直径、GSH含量与卵母细胞成熟的关系

有许多研究者认为，卵母细胞的直径大小也是其成熟的指标之一。Anguita等报道，卵母细胞直径比卵泡直径更能反应其成熟和发育能力[10]。Izumi等报道，猫体内卵母细胞与卵泡同步发育[11]。在早期，Crozet等报道，卵母细胞只有达到一定直径（家畜约110 μm）后才获得完成减数分裂发育到MⅡ期的能力[4]，牛直径110 μm、猪直径l15 μm 的卵母细胞可以完成减数分裂发育至核成熟[12]。本研究结果表明，培养24 h后，随着卵泡的增大，卵母细胞直径有所增加，中卵泡卵母细胞的直径（115.5 μm）比大卵泡卵母细胞的直径（115.1 μm）长约0.4 μm，但都极显著大于小卵泡卵母细胞的直径（111.8 μm），与早期报道的牛的卵母细胞直径长度[12]基本一致。在成熟率上，小卵泡卵母细胞极显著低于中卵泡卵母细胞，并显著低于大卵泡卵母细胞，小卵泡卵母细胞直径和成熟率都低于中卵泡和大卵泡，可见卵母细胞直径的大小可以间接反映其成熟情况。此外，也有研究者认为体外成熟后卵母细胞内GSH含量也可作为卵母细胞胞质成熟的标志[13]。Abdoon等研究表明，培养后排第二极体卵母细胞的GSH含量明显高于未成熟的卵母细胞[14]。本研究结果表明，小卵泡卵母细胞内GSH含量显著低于中卵泡和大卵泡，结合上文提到的各组间卵母细胞的成熟率，说明卵泡卵母细胞内GSH含量也是其成熟的重要指标之一。

3.4 卵泡直径对卵母细胞体外培养效果的影响

在体内，随着卵泡直径增大，RNA逐渐在卵母细胞内蓄积，只有在较大的卵泡（≥2 mm）中卵母细胞才能储存足够量的RNA，以维持随后的体外受精和发育。小于2 mm卵泡内的COCs因周围环境中缺乏某些因子而限制了后期的发育[15]。早期Crozet等对山羊的研究结果显示，直径小于 3 mm 卵泡卵母细胞能完成体外成熟和体外受精，但受精卵一般只能发育到8细胞期或16细胞期，而大卵泡卵母细胞受精卵基本都能发育到桑葚胚或囊胚[4]。本研究结果表明，在成熟率上，小卵泡卵母细胞极显著低于中卵泡卵母细胞，并显著低于大卵泡卵母细胞，与Feng等的研究结果[15]类似。同时，本研究发现小卵泡卵母细胞在体外成熟培养时，死亡现象明显多于中、大卵泡卵母细胞，可能是因为小卵泡卵母细胞体内的RNA或其他物质合成储存不足，不适宜培养，而直径较大卵泡卵母细胞在体内已趋于易于成熟的阶段；但是并没有出现像Pavlok等提出的过度成熟而导致的老化现象[16]。在卵裂率上，随着卵泡直径增大，卵裂率增加，但各组间无显著差异，这与Crozet等的结果[4]不符，可能是因为本试验做的是孤雌激活，没有做体外受精，还有可能是由山羊与绵羊之间的物种差异造成的。在囊胚率上，随着卵泡直径增大，囊胚率升高，中、大卵泡卵母细胞之间差异不显著，但都极显著高于小卵泡卵母细胞，即小卵泡卵母细胞基本获得了核成熟能力（排第二极体），能够完成受精和卵裂；但只有中、大卵泡卵母细胞才能进一步支持受精卵发育到囊胚，这与Han等[17]、Crozet等[4]的研究结果类似。此外，很多研究者在做卵泡直径对卵母细胞体外培养的影响研究时，基本都只是培养到囊胚阶段，而在本研究中又继续对囊胚Hoechst细胞染色。早期Brison等研究表明，囊胚细胞数是评价胚胎发育质量的一个重要指标，内细胞数越多越易于附植和妊娠[18]。本研究结果显示，中卵泡卵母细胞的囊胚细胞总数显著高于小卵泡组，但与大卵泡组差异不显著。本研究结果比牛[19]、小鼠[20]未分卵泡直径但利用BCB筛选、体外受精的对照组囊胚总细胞数高，主要原因可能是孤雌激活的囊胚细胞总数本身就比体外受精的高（本实验室得到孤雌激活的囊胚细胞总数比体外受精的高），也有可能是不同物种的差异造成，具体原因还需继续研究。可见卵泡直径对卵母细胞体外培养效果有显著影响，中、大卵泡的卵母细胞有更大的体外发育潜力。endprint

4 结论

综上所述，本研究认为，同一卵巢的表面可回收利用的卵母细胞数量有限，卵巢表面卵泡直径≥2 mm的卵母细胞可以作为卵子的主要来源，并且能够生产大量的体外胚胎，为胚胎工程提供重要依据；但<2 mm卵泡卵母细胞的利用价值不高的原因还需进一步从分子的角度继续深入研究。

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