EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代细胞生物特性的比较研究

李 慧, 李秀娟， 古力热巴·夏依买旦， 阿曼古丽·如则， 吴 江, 聂永梅

(新疆医科大学1基础医学院生理学教研室, 乌鲁木齐 830011; 2基础医学院病理生理学教研室, 乌鲁木齐 830011;3第二附属医院心电图室, 乌鲁木齐 830063)

血管内皮细胞分布于全身各组织器官，传统认为其功能是促进水及小分子物质交换,是位于血液与间质组织间的一层半透性屏障。近年来发现内皮细胞可分泌多种生物活性物质通过进入循环、旁分泌或自分泌等方式作用于靶细胞，对机体进行调节。血管内皮细胞功能障碍的发展后果已成为血管性疾病关注的热点[1-2]。细胞实验已经成为不可或缺的研究方法。相关的疾病主要有高血压、冠心病、动脉粥样硬化及肿瘤恶化[3]。对血管内皮细胞功能的研究常用的是脐静脉内皮细胞，主要有原代脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)和EA.HY926人脐静脉内皮细胞株。本实验在建立原代人脐静脉内皮细胞体外分离和培养方法的同时，比较原代人脐静脉内皮细胞与 EA.HY926人脐静脉内皮细胞株的生物特性，为血管性疾病研究的细胞来源的选择提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1材料原代细胞：来源于新疆医科大学第一附属医院产科健康剖宫产产妇分娩后所取的新生胎儿脐带，长度15～20 cm。EA.HY926人脐静脉内皮细胞株来自上海细胞库。

1.2试剂M199培养基(Hyclone 美国)，胎牛血清(Gibco 美国)，内皮细胞生长因子(ECGS Millipore)，Ⅱ型胶原酶(Worthington 美国)，胰酶(Biosharp)，双抗/青链霉素合剂(Gibco 美国)，内皮细胞Ⅷ因子相关抗原免疫组化试剂盒(中杉)，PBS液(自配)，MTT(自配)。

1.3方法

1.3.1 EA.HY926细胞株的培养方法 按细胞数>1×105个/mL接种到25 cm2的培养瓶中，M199生长液(含10%的胎牛血清、1%青链霉素合剂、肝素的M199培养基)培养，置于5%CO2细胞培养箱中，24 h后取出观察细胞生长。

1.3.2 原代细胞培养方法 无菌条件下取健康剖宫产产妇分娩的新生儿脐带(离体时间<4 h)，长度15～20 cm，在超净台内用D-Hanks 液冲洗脐带表面，去除脐带两端约0.5 cm的易污染及血肿部分以便分清脐静脉;立即用含1%双抗的PBS液冲洗脐静脉管腔至无肉眼血色。向管腔灌注Ⅱ型胶原酶后用止血钳封闭脐带的两段，置37℃培养箱中消化18 min，其间按压脐带2～3次，使血管壁上的内皮细胞彻底消化下来，加生长液[含 20%的胎牛血清、1%青链霉素合剂、25%的内皮细胞生长因子(ECGS)和肝素的M199培养基[4]]终止消化后收集细胞至50 mL离心管中， 1 000 r/min离心5 min。弃去上清液，加入2 mL的生长液使细胞重悬并计数,要求>1×106个/mL。移至25 cm2的培养瓶中，加生长液到4 mL，移至培养箱后立即水平十字架摇动培养瓶使细胞均匀贴壁。静置培养48 h后换液1次，之后每2～3天换液1次。显微镜下观察细胞的生长状况, 2～3 d后可传代[5]。

1.3.3 原代细胞及EA.HY926细胞株的鉴定 (1)倒置显微镜形态学鉴定：细胞长满以后，倒置显微镜下观察细胞的形态并照相。(2)透射电镜形态学鉴定：透射电子显微镜观察内皮细胞超微结构及内皮细胞特异性Webel-Palade小体。(3)Ⅷ因子相关抗原免疫组化检查：第2代或第3代的内皮细胞按1×105个/mL的浓度种植在35 mm的培养皿中，待细胞生长融合以后，用ABC法进行免疫组化染色，观察及照相;苏木素染色以后观察及照相，不同批次的细胞重复5次，用Image-Pro Plus 6.0软件进行平均光密度评分，结果进行统计学分析。(4)细胞增长曲线的绘制：分别取对数生长期细胞，将细胞按一定密度(最终浓度：原代细胞为1.6×104个/mL，细胞株为2.5×105个/mL)接种于96孔细胞培养板，100 μL/孔，24 h后每孔加入MTT(200 μL/孔),37℃、5%CO2培养箱孵育4 h，小心吸去上清，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振摇10 min，在酶标仪490 nm吸光值的条件下测OD值，连续测6 d，以OD值绘制曲线。

2 结果

2.1倒置显微镜下形态学观察比较EA.HY926细胞株有类管腔样结构形成，但细胞形态单薄，胞内颗粒状物质多，细胞可长成复层(图1a)。原代HUVECs多呈椭圆形或小三角形、短梭形，第3～4天汇合成单层，细胞边界清楚,胞质丰富，胞核呈圆形或椭圆形，偶见双核，密集处呈铺路石状镶嵌排列，稀疏处为短梭形。传代培养的细胞形态饱满，伸展呈长梭形，漩涡状排列生长，细胞贴壁牢固；细胞传至第3代出现管腔样结构(图1b)。

2.2透射电镜观察细胞的超微结构透射电镜下，内皮细胞核清晰，细胞质内微丝、微管结构整齐，在少数细胞核周的细胞质中可见内皮细胞所特有的杆状小体,即Webel-Palade小体,其为质膜所包裹,横切面呈圆形或椭圆形，内有微管样结构。在EA.HY926细胞株里较少见Webel-Palade小体(图2a)，原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)里可发现较多的横切与纵切的Webel-Palade小体(图2b)。

a： EA.HY926细胞株第4天 b：原代HUVECs 第4天 a: EA.HY926细胞株超微结构 b: 原代HUVECs超微结构

2.3 Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色程度比较细胞质染色成棕黄色颗粒的细胞为内皮细胞，免疫组织化学染色结果判定EA.HY926细胞株染色表现为淡黄色(图3a、3b)，用Image-Pro Plus 6.0软件分析平均光密度值为(2 234.02±78.78)；原代HUVECs细胞质表现为棕黄色颗粒(图3c、3d)，用Image-Pro Plus 6.0软件分析平均光密度值为(4 138.8±594.01)。原代HUVECs的染色程度明显较EA.HY926细胞株高，差异有统计学意义(P<0.01)。

a：EA.HY926细胞株Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色 b：EA.HY926细胞株Ⅷ因子相关抗原免疫组化苏木素细胞核染色 c：原代HUVECsⅧ因子相关抗原免疫组化染色 d：原代HUVECsⅧ因子相关抗原免疫组化苏木素细胞核染色

2.4细胞增长情况原代HUVECs 48 h开始进入生长期，96 h达到高峰后，细胞开始衰老，趋向凋亡(图4a)。EA.HY926细胞株48 h开始进入生长期，96～120 h达到高峰后，进入稳定生长，生长幅度较小(图4b)。

3 讨论

脐静脉内皮细胞是血管细胞实验主要的内皮细胞来源，原代HUVECs研究方法在不断地改进,原代细胞培养的具体方法有组织块移植法、机械刮取法以及酶消化法[6]，酶消化法配制简单,细胞贴壁良好，2～3 d即可传代[5,7]，以其操作简单、费用低廉遂逐渐替代前2种方法。

EA.HY926人脐静脉内皮细胞株是人脐静脉内皮细胞和人肺腺癌细胞株A549杂交成的永生化细胞株，具有血管内皮细胞的特性，已广泛用于内皮细胞相关研究。本研究对培养EA.HY926细胞株和原代HUVEC进行比较，发现2种细胞的培养方法和生物特性都有一定的不同，主要表现在以下几个方面：(1)2种细胞所用的M199生长液配制成分不同。(2)在细胞的传代方面，长满的原代HUVECs(25 cm2)用1 mL的0.02 %EDTA+0.05%胰酶消化液消化效果最佳，在2～3 min时间可以消化95%以上的贴壁细胞;而EA.HY926细胞株用0.25%的胰酶消化液效果最佳，在1～2 min时间可消化95%以上的细胞。(3)透射电子显微镜观察2种细胞超微结构，原代HUVECs中易发现较多的纵切与横切Webel-Palade小体，而EA.HY926细胞株上较少见。(4)对Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色结果统计分析后，2种细胞染色程度差异有统计学意义，原代细胞染色程度高于EA.HY926细胞株。(5)由细胞增长曲线可明显看出，原代HUVECs比EA.HY926细胞株脆弱，生长期较短，不能复层生长；而EA.HY926细胞株性能稳定，生长期较长，可复层生长。

a:原代HUVECs生长曲线 b: EA.HY926细胞株生长曲线

总之，原代HUVECs形态和生物特性较EA.HY926细胞株完整，但培养耗时长，产量低于EA.HY926细胞株，易出现杂细胞的污染，细胞的增殖能力有限，必须加入生长因子，花费较高，且细胞的活力与表型随着供者的代数的不同而不同，造成系统误差较大。EA.HY926细胞株虽生物特性较原代差，但操作简便，具有一定程度的原代HUVECs所具有的生物特性，细胞均一以及增长旺盛，适用于较复杂的、细胞创伤较大的体外内皮细胞的研究。

参考文献:

[1] 蔡维霞，梁亮．人脐静脉血管内皮细胞体外培养方法的研究[J]．中国修复重建外科杂志，2011，25(2)：139-147．

[2] Siow RC． Culture of human endothelial cells from umbilical veins[J]．Methods Mol Biol，2012，806: 265-274．

[3] Baudin A，Bruneel A，Bosselut N，et al．A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells[J]．Nature Protocols，2007，2(3)：481-485.

[4] 王皓，张静生．人脐静脉内皮细胞的体外培养[J]．中西医结合心脑血管病杂志，2008，6(3)：368-369．

[5] 张瑛，邹和群．改良酶消化外培养人脐静脉内皮细胞[J]．山西医科大学学报，2012，43(6)：476-478．

[6] Kadam SS,Tiwari S,Bhonde RR.Simultaneous isolation of vascular endothelial cells and mesenchymalstem cells from the human umbilical cord[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2009,45(1-2) :23-27.

[7] 白燕慧，张明昌．胰蛋白酶消化法体外培养和鉴定人脐静脉血管内皮细胞[J]．中国组织工程研究，2012，16(15)：2695-2698．