心理应激对大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞MMP-3和TIMP-3表达的影响

肖 朋， 黄 旭， 刘海霞， 王 兵

(新疆医科大学1第二附属医院口腔科， 乌鲁木齐 830028； 2第五附属医院口腔科， 乌鲁木齐 830011)

心理应激是机体在受到各种强烈的刺激因素时，内外环境超出正常阈值，出现以交感神经兴奋和垂体肾上腺皮质分泌增多为主的一系列神经内分泌反应，持续的心理应激与疾病有着密切的关系，对某些疾病的发生、发展和转归都有着重要的影响[1]。心理应激对颞下颌关节也同样有重要的影响，本课题组前期研究发现，心理应激状态之下大鼠颞下颌关节的组织结构发生改变，特别是关节软骨发生了光泽度以及软骨层变薄等形态学改变[2]。软骨的合成和降解受到诸如化学、力学以及免疫学等多因素的影响，正常的关节软骨处于一种精妙的合成与分解的动态平衡中。当关节软骨受到不利刺激时，导致软骨的降解大于合成，此时软骨被破坏[3]。基质金属蛋白酶及其抑制剂是维系软骨合成和降解的重要成分，基质金属蛋白酶-3(Matrix Metalloproteinase-3 ，MMP-3)和金属蛋白酶组织抑制剂-3(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-3 ，TIMP-3) 就是其典型代表[4]。本实验应用免疫组化方法，研究大鼠颞下颌关节髁突软骨中MMP-3和TIMP-3的表达情况，初步探讨心理应激对大鼠颞下颌关节髁突软骨改变的机制。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 实验动物 48只成年雄性Wistar大鼠，体质量(170±10)g，清洁级，动物及饲料均由新疆医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 动物分组和处理 将48只大鼠随机分为实验3 w组、实验6 w组、实验刺激去除后6 w组(恢复组)和空白对照组，每组12只。对3个实验组大鼠分别施加足底电击、制动、气候箱和食物诱惑4种刺激方式，建立大鼠心理应激动物模型，并对动物模型进行评价，对照组不施加任何刺激。分别在3、6 w时间点处死实验3、6 w组大鼠，恢复组大鼠先刺激6 w后，停止刺激，正常环境饲养6 w后处死，对照组与恢复组大鼠一同处死。采用乙醚麻醉下颈椎脱臼处死方法。

1.1.3 动物取材与标本处理 将动物处死后立即进行解剖，颞下颌关节所取标本结构包括关节盘、髁状突和包绕髁突颈部的部分关节囊。将标本固定、脱钙，常规蜡块包埋，4 μm切片。切片时沿关节头矢状方向从髁突中1/3切开，制作切片中包括关节盘、关节软骨、关节骨质、骨髓腔和关节囊髁颈部附着转折处内面滑膜。

1.2免疫组化方法采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接(S-P)法，按试剂盒说明书进行操作。抗MMP-3抗体、抗TIMP-3抗体、SP试剂盒、DAB显色剂均购自北京鼎国生物科技有限公司。MMP-3和TIMP-3在髁突软骨细胞出现棕色或棕黄色染色为阳性，阳性细胞及间质着色水平明显高于背景。计数评判方法参考苏书娟等[5]采用的方法，随机计数3个400倍视野下细胞总数及阳性细胞数，计算阳性细胞百分率，依阳性率高低共分为4个等级：阴性“-”(无阳性细胞)，弱阳性“+”(阳性细胞<25%)，阳性“++”(阳性细胞25%～50%)，强阳性“+++”(阳性细胞>50%)。由病理科医师盲法协助读片并报告、采图。

1.4统计学处理采用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，进行多个样本的等级秩和检验，即H检验，组间多重比较采用Z检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞MMP-3的表达情况MMP-3在4组大鼠颞下颌关节软骨细胞的胞质和细胞间质中均出现不同程度棕色或棕黄色颗粒状着色，着色水平明显高于背景非特异染色。其中尤以实验6 w组细胞出现阳性染色多，细胞阳性强度达到“++”～ “+++”，实验3 w组和恢复组细胞阳性染色数量递减，对照组细胞阳性染色数量最少，阳性强度为“-”～ “+”，见图1～4。4组大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞中MMP-3表达强度差异有统计学意义(Hc=17.774，P=0.001)。实验3 w组和实验6 w组中MMP-3表达强度明显高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞MMP-3表达情况/只

2.2大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞TIMP-3的表达情况TIMP-3在4组大鼠颞下颌关节软骨细胞的胞质和细胞间质中亦出现不同程度棕色或棕黄色颗粒状着色，且着色水平明显高于背景非特异染色。其中尤以恢复组细胞出现阳性染色多，细胞阳性表达强度达到“++”～ “+++”，实验6 w和实验3 w细胞阳性染色数量递减，对照组细胞阳性染色数量最少，阳性表达强度为“-”～ “+”，见图5～8。4组大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞中TIMP-3表达强度差异有统计学意义(Hc=8.854，P=0.031)。恢复组TIMP-3表达强度明显高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞TIMP-3表达情况/只

图1 对照组大鼠颞下颌关节软骨细胞MMP-3表达(×400)

图2 刺激3 w组大鼠颞下颌关节软骨细胞MMP-3表达(×400)

图3 刺激6 w组大鼠颞下颌关节软骨细胞MMP-3表达(×400)

图4 恢复组大鼠颞下颌关节软骨细胞MMP-3表达(×400)

图5 对照组大鼠颞下颌关节软骨细胞TIMP-3表达(×400)

图6 刺激3 w组大鼠颞下颌关节软骨细胞TIMP-3表达(×400)

图7 恢复组大鼠颞下颌关节软骨细胞TIMP-3表达(×400)

图8 刺激6 w组大鼠颞下颌关节软骨细胞TIMP-3表达(×400)

3 讨论

关节软骨属于透明软骨，由致密结缔组织的胶原纤维构成，表面光滑，有光泽。软骨细胞由浅层向深层逐渐由扁平样至椭圆或圆形的细胞组成，这些软骨细胞维持关节软骨的正常代谢。

基质金属蛋白酶(MatrixMetalloproteinases，MMPs)是20世纪末发现的一组蛋白酶家族，其中包括胶原酶、明胶酶、间质溶解素和膜型基质金属蛋白酶4种类型，目前已发现的至少有25个成员，在细胞外基质和骨质的稳定以及炎症性溶骨性疾病中起到了重要的作用[6]。

MMP-3为间质溶解素的一种，又称基质裂解素，主要来源于活化的结缔组织细胞，具有裂解纤维粘连蛋白、蛋白聚糖、明胶、层粘连蛋白、弹性蛋白及IV、IX、X型胶原的功能。MMP-3是目前公认的与骨关节病关系密切的基质金属蛋白酶之一，不仅能够降解软骨细胞外基质中的主要成分，而且可以促使破骨细胞的迁移和粘附，导致细胞外基质降解破坏[7]。MMP-3在风湿性关节炎和骨反应性关节炎患者的骨和软骨的破坏过程中发挥着重要作用[8]。本实验结果显示，实验3w组、实验6w组MMP-3表达阳性强度明显高于对照组和恢复组，MMP-3表达强度的高低与大鼠颞下颌关节组织结构病变程度趋势基本一致，即在大鼠颞下颌髁突软骨出现粗糙、变薄、裂隙等[2]组织结构变化处MMP-3表达阳性率高，此结果显示MMP-3过表达可能与颞下颌关节组织结构破坏有关。

金属蛋白酶组织抑制剂(TissueInhibitorofMetalloproteinase，TIMPs)的作用是在MMP的激活过程中，与MMP的中间体结合，从而抑制MMP的激活，使其浓度降低，从而阻止了细胞外基质的降解，TIMPs是软骨组织中MMPs活性最重要的调节因素[9]。MMPs与TIMPs之间的比例失衡状态被认为是软骨基质破坏的重要因素[10]。MMPs与TIMPs平衡可系统调控成骨细胞分化与破骨细胞的骨吸收，从而完成病变骨质的修复[11]。本实验结果显示恢复组TIMP-3表达强度明显高于对照组，恢复组TIMP-3高表达，与恢复组大鼠颞下颌关节组织结构修复性改变一致，表明TIMP-3可能在软骨组织修复中发挥了重要作用。此外，实验3w组和实验6w组MMP-3的表达较高，而TIMP-3在以上两组中的表达亦稍高，表明大鼠髁突软骨细胞在发生组织结构破坏的同时，存在一定的组织修复，但MMP-3发挥的破坏作用大于TIMP-3的修复作用，破坏占据主要地位。Gomes等[12]发现在高转移性乳腺癌细胞中，TGF-β1细胞因子通过MAPKs信号通道作用于基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制剂之间的平衡，即细胞外基质破坏与抗破坏之间的平衡，上调ERK1/2信号通路可增加金属蛋白酶组织抑制剂的表达，表现为抗破坏细胞外基质作用增强。所以，今后或许可以寻找一种通过调控此途径的方法来减弱心理应激对大鼠颞下颌关节髁突软骨的破坏作用。

综上所述，在心理应激刺激之下，大鼠的颞下颌关节组织结构内发生了代谢性的紊乱，MMP-3和TIMP-3分别在髁突软骨的破坏和修复中发挥了一定的作用，但应激与髁突软骨破坏和修复之间的作用机制尚未明了。大鼠在应激作用下，机体可能是通过一些细胞因子和细胞通道来调控MMPs和TIMPs之间的平衡，进行此方面的研究或许能为应激作用下髁突软骨细胞变化的作用机制提供支持。

参考文献:

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