VEGF、核内EGFR及CD105在早期非小细胞肺癌的表达及临床意义研究

王月栋， 刘 凯， 黄 莉， 葛 红， 王若峥

(1新疆医科大学附属肿瘤医院放疗一科, 乌鲁木齐 830011； 2河南省肿瘤医院胸部放疗科, 郑州 450000)

2013年《世界癌症报告》显示，肺癌仍是目前最常见的肿瘤之一,发病率及死亡率极高。近年来人们对NSCLC的发生发展的机制有了进一步的理解，认为肿瘤组织新生血管的增加是引起肿瘤生长和转移的重要因素[1]。有研究显示血管内皮生长因子和表皮生长因子受体通过诱导新生血管形成促进肿瘤的生长发生、扩散和转移[2]。既往EGFR被认为只能在细胞膜与配体结合发挥生物学效应，最近越来越多的研究发现在多种肿瘤组织(皮肤癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、肾上腺皮质癌、口腔癌和甲状腺癌等)细胞核有高表达的EGFR，并且核内EGFR的表达与肿瘤的发生发展及预后密切相关[3]。CD105作为血管内皮标记物之一，主要在肿瘤细胞新生血管表达，研究表明检测CD105的表达情况可作为肿瘤组织中新生血管的主要标志[4]。本研究采用免疫组化法检测VEGF、核内EGFR及CD105的表达，分析其与早期非小细胞肺癌发生发展的关系及VEGF、核内EGFR、CD105表达间的相互关系。

1 资料与方法

1.1临床资料选取2011年1月-2013年8月新疆医科大学附属肿瘤医院病理科存档的初治早期NSCLC手术切除后的石蜡包埋标本30例。其中男性20例，女性10例，年龄46～79岁，平均年龄64.1岁(中位年龄67岁)，按第7版国际肺癌分期标准分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期12例。对照组为NSCLC石蜡包埋标本的癌旁正常组织。全组患者术前均未行放疗或化疗，无淋巴结转移，无合并其他原发肿瘤。有完整的临床及病理学资料并具有可供切片分析的足够质量及数量的组织标本。病理切片诊断由2位具有主治医师及以上职称的病理科医师根据世界卫生组织相关标准进行判读确定。

1.2随访情况采用查询住院病历或电话随访患者的方式进行随访，以开始手术当天作为随访开始时间，随访日期截止于2013年8月31日，所有的病例均随访到患者肿瘤复发、转移、死亡或至本次随访的截止日期，随访时间为2～28个月(中位随访时间17个月)，失访1人，随访率为96.7%。

1.3检测方法免疫组织化学法：使用的一抗为兔抗人EGFR单克隆抗体、兔抗人VEGF单克隆抗体、兔抗人CD105单克隆抗体(均购自美国Santa Cruz公司)。免疫组化SP试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中衫金桥公司。采用二步法按照试剂盒操作说明进行操作。

1.4结果判定VEGF阳性染色定位于细胞浆中，以细胞浆中出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，阳性细胞数≤10%为阴性(-)，阳性表达细胞数>11%为阳性(+)。核内EGFR阳性染色定位于细胞核及核膜，以细胞核及核膜出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，阳性细胞数≤10%为阴性(-)，阳性表达细胞数>11%为阳性(+)。CD105阳性染色为细胞胞浆或胞膜有棕黄色颗粒。参照Weidner法，在低倍镜下选择肿瘤微血管数量最丰富的区域，在400倍视野下计数上述细胞核、细胞浆及细胞膜的血管数，取其平均值作为MVD(微血管密度)。计数时凡呈现单个内皮细胞或内皮细胞群者和临近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，就将其作为1个微血管，但肌层较厚及管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数。

1.5统计学处理采用SPSS17.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料组间比较用t检验，计数资料用卡方检验或四格表确切概率检验，两者相关性用非参数Spearman等级相关分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1VEGF、核内EGFR及CD105标记的MVD在早期NSCLC癌组织和癌旁组织的表达30例早期非小细胞癌组织中VEGF阳性表达率为53.5%(16/30)，核内EGFR阳性表达率为16.7%(5/30)，CD105标记的MVD值为(17.3±5.6)。癌旁正常组织中VEGF阳性表达率为26.7%(8/30)，核内EGFR阳性表达率为0%(0/30)，CD105标记的MVD值为(8.9±4.2)。癌组织中VEGF和MVD值明显高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，癌组织中核内EGFR阳性表达率虽然高于癌旁正常组织，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2VEGF、核内EGFR的表达及CD105标记的MVD与患者临床特征的关系VEGF及核内EGFR在复发转移组和非复发转移组的阳性表达率分别为100.0%、45.8%和80.0%、4.2%，差异均具有统计学意义(P<0.05)，而与患者年龄、性别、吸烟、肿块大小、病理类型、临床分期、分化程度、解剖学类型无关。CD105标记的MVD值与患者的年龄、性别、吸烟、肿块大小、病理类型、临床分期、分化程度、解剖学类型及是否复发转移无关，见表2。

表1 VEGF、核内EGFR及CD105标记的MVD在早期NSCLC癌组织和癌旁组织的表达/例(%)

表2 VEGF、核内EGFR的表达及MVD与患者临床特征的关系/例(%)

2.3癌组织中VEGF、核内EGFR与CD105标记的MVD值表达的关系经Spearman等级相关分析显示，在早期非小细胞肺癌组织中VEGF阳性表达与CD105标记的MVD值呈正相关(r=0.489，P=0.006)，VEGF的表达与核内EGFR的表达、核内EGFR的表达与CD105标记的MVD值在早期非小细胞肺癌组织中无明显相关性(r=0.239，P=0.203；r=0.333，P=0.073)。

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌约占80%，是导致肺癌发病率及死亡率较高的主要原因。肺癌的发生发展和转移与其他实体肿瘤一样，都依赖于新生血管的形成。VEGF、EGFR可促进血管新生，与非小细胞肺癌的发生、发展密切相关。

VEGF由定位于人类染色体6q21.3的VEGF基因编码形成的蛋白产物，可与血管内皮细胞特异性地结合诱导新血管形成，被认为是目前已知的作用最强的促血管生成因子。有研究报道VEGF在NSCLC组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，并且与有无淋巴结转移和临床分期有关[5]。Yi等[6]的研究表明VEGF在癌组织中的表达明显高于正常组织，并与肿瘤分化程度、临床分期及有无淋巴结转移有关。本研究显示VEGF在早期NSCLC组织中的阳性表达率为53.3%，明显高于癌旁正常组织16.4%的阳性表达率，差异有统计学意义，与上述文献报道基本一致。尹志永等[7]研究也证实了在非小细胞肺癌中组织中VEGF的表达明显高于对照组，并且与肿瘤的分化程度、有无淋巴结转移有关。本研究显示VEGF的表达与患者是否复发转移有关，而与患者年龄、性别、吸烟、肿块大小、病理类型、临床分期、分化程度、解剖学类型无关，与文献[7]报道结果不太一致。可能由于本研究样本数少，纳入病例全部为早期非小细胞肺癌，且排除了有淋巴结转移的患者有关。VEGF的表达与转移复发有关，能否提示VEGF高表达更容易导致肿瘤的复发及转移还需进一步临床研究。有研究显示多种恶性肿瘤的血液和尿液中均能检测到VEGF的高表达，并且与肿瘤的分期与预后相关[8]。因此检测早期非小细胞肺癌中VEGF的表达对判断患者的病情及预后可能有一定的指导作用。

EGFR为一单跨膜糖蛋白，构成细胞信号传递系统的一部分。研究证明EGFR家族及其配体能诱导多种癌的发生，与多种肿瘤的发生发展、恶性程度及预后等密切相关[9]。既往认为EGFR为细胞膜受体，仅在细胞膜表面与配体结合发挥其生物学效应，不能进入细胞核。后来在皮肤癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌和口腔癌多种肿瘤组织细胞核内发现了高表达的EGFR。有学者通过研究核内EGFR表达水平不同的乳腺癌和口咽鳞癌病例，发现核内EGFR表达的患者临床预后相对较差，局部易复发、远处转移，并且核内EGFR表达的水平与生存时间呈负相关，表明核内EGFR可作为预后不良的指标[10-11]。Traynor等[12]研究发现早期NSCLC组织中核内EGFR表达的与临床分期及病理类型有关，并且核内EGFR蛋白表达阳性的患者无病生存期及总生存期较短，提示核内EGFR受体可作为独立的预后因子，将会成为非小细胞肺癌治疗的新靶点。本研究显示早期非小细胞肺癌组织中核内EGFR蛋白阳性表达率为16.7%，明显高于癌旁正常组织的0%，但差异无统计学意义，可能与纳入病例数较少有关。核内EGFR的表达与患者复发转移相关，而与患者年龄、性别、吸烟、肿块大小、病理类型、临床分期、分化程度、解剖学类型无关，能否提示核内EGFR表达阳性的患者更容易发生复发转移有待于大量的研究验证。对于核内EGFR在早期非小细胞肺癌的表达国内目前仍是空白，仍需在以后的工作中扩大样本量更进一步研究。

大量研究表明肿瘤的发生发展依赖于血管生成，新生血管的形成同时增加了肿瘤发展及转移的机会。衡量肿瘤血管生成的指标常采用微血管密度值。Marioni等[4]认为CD105可作为血管内皮标记物之一，主要在肿瘤细胞新生血管表达，因此可通过CD105研究新生血管在肿瘤组织中的作用。Mineo等[13]研究发现CD105在新生血管内皮细胞中表达显著增高，与NSCLC新生血管转移存在着明显的关系，可作为新生血管的标记物。董赟等[14]研究发现在NSCLC中CD105标记的MVD明显高于正常组织，与肿瘤的生长、浸润及转移密切相关。本研究中肺癌组织中CD105-MVD明显高于癌旁正常组织CD105-MVD，差异具有统计学意义，与文献报道相一致。Offersen等[15]研究发现CD105-MVD与肿瘤的复发、转移和预后有关。李红芳等[16]研究发现脑转移组的MVD值明显高于无脑转移组，提示CD105的表达与肿瘤的生长和浸润明显相关。本研究中CD105-MVD值与患者的年龄、性别、吸烟、肿块大小、病理类型、临床分期、分化程度、解剖学类型及是否复发转移无关。这可能与病例数较少、所有纳入患者标本均为早期非小细胞肺癌并且均没有淋巴结转移有关，尚需要进一步扩大临床病例数来研究CD105的表达与早期非小细胞肺癌的临床关系。

肿瘤的发生发展是多因素多基因、多阶段的过程，利用单一因素或单一基因不能完全解释肿瘤的发生发展。Shivakumar等[17]研究表明在NSCLC中VEGF表达与CD15-MVD呈正相关，提示VEGF在肿瘤的发生发展的过程中通过增加新生血管的形成来促进癌细胞的侵袭和转移。Byers等[18]研究发现VEGF与EGFR可以共同促进肿瘤的发展，加速肿瘤的侵袭和转移。本研究表明在早期NSCLC组织中VEGF的表达与核内EGFR的表达没有相关性，但经Spearman等级相关性分析显示与CD105标记的MVD值呈正相关，而核内EGFR的表达与CD105-MVD的表达无相关性，可能与本研究纳入病例数少且为早期NSCLC有关，尚需扩大样本进一步研究。

综上所述，早期NSCLC组织中存在VEGF、核内EGFR及CD105的表达，VEGF及CD105的阳性表达率在癌组织及癌旁正常组织中的差异具有统计学意义，VEGF的表达与肿瘤复发转移相关，并且VEGF与CD105标记的MVD值呈正相关，说明VEGF通过促进新生血管的形成加速了早期NSCLC的复发转移。核内EGFR阳性表达率在癌组织及癌旁组织中的差异仍需要扩大样本继续研究。本研究尚未得出早期NSCLC组织中核内EGFR与VEGF、CD105标记的MVD值存在相关性的结论，仍需要进一步扩大临床病例的研究，为临床治疗提供科学依据。

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