6种杀菌剂对不同桉树焦枯病病原菌的室内毒力测定

李国清，陈帅飞＊，刘菲菲，周旭东，谢耀坚

(1. 国家林业局桉树研究开发中心，广东 湛江 524022；2. 富优基尼生物技术(上海)有限公司，上海 200235)

6种杀菌剂对不同桉树焦枯病病原菌的室内毒力测定

李国清1，陈帅飞1＊，刘菲菲1，周旭东2，谢耀坚1

(1. 国家林业局桉树研究开发中心，广东 湛江 524022；2. 富优基尼生物技术(上海)有限公司，上海 200235)

由丽赤壳属(Calonectria)真菌引起的桉树焦枯病是桉树世界范围内的重要病害之一。为了筛选能有效抑制丽赤壳属病原菌的杀菌剂，本研究采用6种杀菌剂(百菌清、代森锰锌、多菌灵、甲基硫菌灵、嘧菌酯、咪鲜胺)对5种桉树丽赤壳属病原菌(Ca. cerciana、Ca. crousiana、Ca. fujianensis、Ca. pauciramosa、Ca. pseudoreteaudii)通过菌丝生长法测定其室内毒力强弱。结果显示：6种杀菌剂对5种丽赤壳属病原菌均有一定的抑制作用，且差异显著。不同杀菌剂对同一丽赤壳属病原菌的抑制效果差异显著，不同丽赤壳属病原菌对同一杀菌剂的敏感性也存在差异。综合比较分析，咪鲜胺能有效发地抑制本研究中测定的丽赤壳属病原菌菌丝生长。

桉树；焦枯病；丽赤壳属；杀菌剂；毒力测定

桉树焦枯病是由丽赤壳属(Calonectria)真菌引起的在热带和亚热带地区广泛发生的一类世界性病害，丽赤壳属真菌能够危害桉树叶片和枝梢，形成典型的烂叶和枯梢症状，严重影响桉树的生长[1-3]。在我国，桉树焦枯病自报道以来一直备受关注，1991—1992年在广西零星发生，1993年大面积流行发病，1996年桉树焦枯病被列入到国内森林病虫害检疫名单，其后大面积流行时有发生[4-6]。桉树焦枯病主要发生在广西、广东、福建、云南和海南等地区的桉树人工林中，严重影响我国桉树人工林的健康发展[7-8]。丽赤壳属真菌物种多样性高、分类鉴定难等原因，导致桉树焦枯病防治难度较大。目前，引起华南地区桉树焦枯病的病原菌有 Ca. cerciana、Ca. crousiana、Ca. fujianensis、Ca.pauciramosa、Ca. pseudocolhounii和Ca. pseudoreteaudii共6种[2-3]。

我国针对桉树焦枯病的化学防控研究已有报道，研究对象大都是一种丽赤壳属病原菌[9-11]。由于同一区域存在不同的桉树焦枯病病原菌[12]，对单一病原菌抑制效果好的杀菌剂不一定具有广谱杀菌性。截至目前，尚未见对不同桉树焦枯病病原菌进行化学防控的报道。本研究选用6种常用杀菌剂对在我国发现的5种桉树焦枯病病原菌进行室内毒力测定，以期为幼林以及苗圃中丽赤壳属病原菌引起病害的防控提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 供试病原菌

桉树焦枯病病原菌包括到目前为止在我国桉树上发现和鉴定的5个Calonectria种，菌株包括5个Calonectria种的正模标本菌株[2-3,12]，菌株来自于国家林业局桉树研究开发中心森林健康课题组菌种保藏库和南非比勒陀利亚大学–林农生物技术研究所菌种保藏中心(表1)。所有病原菌转接于2% MEA培养基中培养7 d待用。

表1 试验所用桉树焦枯病病原菌菌株信息

1.2 供试杀菌剂

供试杀菌剂共9种，各药剂有效成分及生产厂家见表2。

表2 试验所用杀菌剂信息

1.3 供试培养基

2% MEA培养基(20 g麦芽粉，20 g琼脂，1 L水)；含药剂MEA培养基：将供试药剂用无菌水配制成稀释100倍母液，然后取母液加入冷却至55℃左右的2% MEA培养基中，配制成有效成分浓度稀释分别为500、1 000、4 000、10 000倍的含药剂MEA培养基(表3)，倒入培养皿中备用。

表3 各供试药剂不同稀释倍数下有效浓度(mg·m L-1)

1.4 试验方法

预试验选用 9种杀菌剂(表 2)对 Ca. cerciana (CMW 25309)、Ca. fujianensis(CMW 27254)、Ca. pseudoreteaudii(CMW 25292) 3种病原菌进行室内毒力测定，初步评价杀菌剂浓度对病原菌生长抑制的影响效应。用直径5 mm的打孔器取培养7 d的病原菌菌饼，转接至不同浓度梯度的含药剂MEA平板中央，每个处理4次重复，设置不含药剂MEA平板为对照。含药剂MEA平板浓度分别是杀菌剂有效成分的1 000、4 000、10 000倍。放置于25℃下培养，8 d后，采用十字交叉法测量并记录菌落直径。

根据预试验结果选用6种杀菌剂(表2*标注)对Ca. cerciana、Ca. crousiana、Ca. fujianensis、Ca. pauciramosai和Ca. pseudoreteaudii 5种桉树焦枯病病原菌进行室内毒力测定。整个试验重复1次以保证试验数据可靠性。抑制率按照以下公式计算[13]。

菌落增长直径=菌落直径−菌饼直径

菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落增长直径−处理菌落增长直径)/对照菌落增长直径×100%

将药剂各浓度(mg·L-1)转换为对数值，各药剂对病原菌的抑制率转换为机率值，建立毒力回归方程，并计算出药剂抑制中浓度EC50和相关系数[14]。

1.5 数据处理

采用SPSS 19.0统计分析软件和Excel进行数据处理分析和整理。

2 结果与分析

2.1 杀菌剂预试验结果

预试验结果见图1，由图中比较分析结果可知，9种杀菌剂对Ca. cerciana(CMW25309)、Ca. fujianensis (CMW27254)、Ca. pseudoreteaudii (CMW25292) 3种病原菌均有不同程度的抑制作用。同一杀菌剂对不同病原菌的抑制作用也存在差异。部分杀菌剂不同浓度对病原菌的抑制效果差异不明显。由此，正式试验选用抑菌效果好或对不同种病原菌抑制差异较大的6种杀菌剂为甲基硫菌灵、多菌灵、代森锰锌、百菌清、咪鲜胺、嘧菌酯；浓度梯度为有效成分的500、1 000、10 000倍杀菌剂稀释液。

2.2 杀菌剂对桉树焦枯病病原菌菌丝生长抑制率比较

6种杀菌剂对5种桉树焦枯病病原菌菌丝生长抑制作用见表4、图2。6种杀菌剂对5种桉树焦枯病病原菌均有一定的抑制作用，且差异显著。杀菌剂浓度有效成分稀释500倍时，咪鲜胺对5种病原菌的抑制率均在90%以上；代森锰锌对5种病原菌的抑制率均在80%以上，其中对Ca. crousiana的抑制率达100%；甲基硫菌灵、多菌灵对Ca. cerciana、Ca. crousiana、Ca. fujianensis的抑制率在98%以上，而对Ca. pauciramosa和Ca. pseudoreteaudii的抑制率均在50%以下。杀菌剂浓度有效成分稀释10 000时，咪鲜胺对5种病原菌的抑制率仍在80%以上；甲基硫菌灵、多菌灵对Ca. cerciana、Ca. crousiana、Ca. fujianensis的抑制率在均在 80%以上，对 Ca. pauciramosa和Ca. pseudoreteaudii的抑制率下降到30%以下；代森锰锌除对Ca. pseudoreteaudii抑制率为58.73%外，对其余病原菌的抑制率均在42%以下；而嘧菌酯、百菌清对5种桉树焦枯病病原菌的抑制率均在40%以下。

同一种杀菌剂对 12株病原菌的抑制效果存在差异，不同杀菌剂对同一株病原菌的抑制效果也存在差异(表4)。此外，不同桉树焦枯病病原菌对同一杀菌剂不同浓度的敏感性也存在差异，总体来说，随着有效成分浓度的升高，杀菌剂对病原菌菌丝生长的抑制率随之提高。在5种桉树焦枯病病原菌中，以Ca. crousiana和Ca. fujianensis对6种杀菌剂的敏感性最高，而Ca. cerciana、Ca. pseudoreteaudii、Ca. pauciramosa的敏感性较低。

均1-H1%平剂菌1.02F1-H 1 1.13G1H1 1.10H1 2.90D1 2.85D1E1 2.93E1 0.33A1 0.44A1 1.11B1 1.90B1 1.88C1 1.62F1 3.51E1 3.36E1 3.17E1 1.09F1G1 1.15F1-H 1 0.99F示制杀.60±29.93±27.00±25.87±66.48±61.02±57.75±9794.19±.94±87.01±87.36±80.82±34.96±58.51±57.04±59.66±33.39±31.95±28z 2 表抑均W25310c/C-E -FD 的c/D-F d/D-F b/C d/C-F 1.83c/A cd/Cb/B 2.23a/B c/G b/F b/EFe/C-F e/F ef/Dd 1e1，a2,b 2…平株菌seudoreteaudii9±1.54CM4.484±8±2.615.354.049.749.004.863.943.972.432.402.0837.233.939.88±25.73±25.71±28.0100a/A3±91.06±66.3100a/A2a/A95.63±72.0±2.83b5.181±17.71±22.72±28.47±17.38±25.68±46.0性有显对著所异剂5292Ca.p2.33b/DG /F1.56a/DF /EH E /GB C -F/C-F/D/H差菌的杀3.91dW2CM.55±.51±2.19e/H1.24a/A2.18b4.36a/B.36±.83±6.30b.96±4.81b.95b/I.82c/I4.88b2.68b2.28a/D5.74a/D5.73ab/EF1.90d1 1.41c2上种45274936.47±40180a/A10.71ab/AB95.88±95.19±85.34±76.09±477.88±26.75±3.76±19.48±56.88±54.73±40.30±50.20±48平每W27203d/F f/FG0.05水示d/G d/FG在Z1表1.671.011.462.53e/G 1.99a/A a/B 1.11a/B bc/C1.16c/E 2.931.49bc/D1.37b/D cd/E1.75f 1 1.620.97率2.063±8±21.65±12.69±16.817.18±13.8±1.15f/H4.64100a/A9±98.00±86.19±88.98±65.96±35.6±1.88c/H1.51±1.61c/H1.32±1.31c/H5.356±42.61±40.99±32.87±37.7制均，A1,B1…抑平性W27199e/H 的著d/E a/B 1.11D f/F a/B bc/C1.661.27d/GHc/I d/I d/FGb/C b/CDab/De 1f1 1.09株显CM7±1±0.281.893±1.972±8±2.241.09±1.26f/I0.710.740.982.209ab/B 菌异19.815.75±18.112.4mosa2.6024.5100a/A95.394.2100a/A1±96.04±41.8±1.65b3.42±1.52c/I2.216±-0.00±45.25±42.24±CM7±39.841.8个差对上每的.83cd/B Ca剂平F 况-G.27e/EW25311G -G.69e/E.28g/E-GC c/CD.25e/E菌情.30f/E.94f/ECMF .34bc/A 4.39±11.51a/A120.89±3.09c/B0.18±18.79±3135.92±2率.90g/E6.31±10a/A2.64d/F2.48d/G2.63e/E.87±4.11cd/CD3.07b.23±2.94cde/D2.33g1 .pauciraz 1表)在制9444.13±1093517.21±2-6.80±-8.94±-5.16±.13±37.93±37.74±29.35±27，a1,b1…(纵e/D W252830.25抑c/D 0.98-Gbc/C0.813.827ab/ABfg/Ec/D 的B B 5.65示0.05水1.391ab/ABf/E 菌0.981.908f/Eg/E 7ab/AB1.87a/B b 1c1 2.21d 2率杀1.17制32.3病2±31.92±CM94.133.7100a/A原0±100a/A96.096.09±8±6±95.08±91.865.47a/A1a/A12.59±100a/A96.0F ±1.46±94.111.76±7±9.67性抑菌13.7病65.243.1著的原枯显株病de/Ha/AB焦c/H c/D c/E W27257异菌b/AB0.82a-c/B a/C b/F 1.28d/G cd/H向0.65B 2.49de/Hd/HId-f/I b 1c1差对树4±桉7±Ca.fujianensis2.106±0.054±0±0.566±6±0.48100a/A4±7.003±1.471.477±1.690.692±0a/A5a/B0.761.810±的剂34.35±32.05±8±33.582.474.6对95.993.888.8CM67.6上菌47.5剂33.5100a/A95.993.833.230.2c/H 26.664.6平杀水种B 菌E c/F 54/EF E /AF 72c/B 杀/D/DF /E0.05每)在表0.98bW246种2.17a/D1.79b0.44a/A2.23ab/B 0.33b0.45b1.00a/C3.41a/B2.33bB 1.32b0.77b1.21a/E1.49a1 1.19a2示CM43.97±41.41±47.99±100a/A99.02±92.06±95.74±92.96±86.23±100a/A92.38±50.30±100a/A96.00a/A94.00a/B47.16±43.89±43.83±75.94±70.35±向…Z表(横制；A率,BH 53H 72-f/G抑性的著.crousianaCMW23.42b/E41.31±0.88a/D52.93±1.48c/F33.76±100a/A96.73ab/A 96.1a/A1.23c/B85.21±1.05d/B87.74±1.69b/C68.85±100a/A96.73a/A1.60de/H 25.06±100a/A96.73a/A96.10a/A1.37e/G27.13±2.36d/G29.49±1.79d28.04±1.80a1b1 70.69±株显菌异同差Ca49B /F不的72/F/A1.66f/Fb/C 1.67d3.09d1.13bc/D 对上1.85a-c/BW21.38a/B剂平2.701.16e/E.87±1.48cd/E 1.51b.43±2.05a1b1 1.36a2 .28±CM菌1619160a/A10.61ab/B 95.41ab/B 93.21±96.61±94.07±940a/A10.61a/B95.59±510a/A10.61a/B95.52a/B94.81±27.49±31.39±36.17±70.54±70杀一0.05水同在。W25309/D-F-F1.38f/D/DB B /AB -F/Cc/C 0.92d示率性B 1.66a/A2.44b.09±2.96ab/B 0.12ab/AB2.25a/A8.03b抑显8.81b2.54ef/DECMB 0.86f/D1.90d1.34ef/EF.70g/F2.32c1 .cerciana …z表制著均异22.16±18.53±15.69±96.20±91.84±880a/A10.15±96.77±92.11±69.89±65.15±210a/A10.27a/A96.40a/A94.64±14.93±119.02±0.61±61a,b母的的平差Ca字菌上5290-H/FH /HB /DD D -De/FGe/E F /E-H同原平W2-C-C不病水CM1.43d.54±2.39f/G1.92d0.47a/A2.48ab/A-D 3.35b2.09a/C5.32a/C3.39a/B1.47d1.33d1.04d1.26f/F2.13a1c1 1.58b2的种.69±.88±.31±.28±.29±0a/A.35ab/A-C .00±.21±.79±.55±0a/A.52a/A.35a/A.25±.63±.18±.10±.36±后每0.052219169993871096929292241094963226216764字对)在数数剂向倍中菌500 103 104 500 103 104 500 103 104 500 103 104 500 103 104 500 103 104 (纵释：稀表杀率剂灵菌锌均均注菌酯硫胺锰灵清平平杀菌基鲜森菌菌株种

图2 6种杀菌剂中3种不同浓度稀释液对5种桉树焦枯病菌菌丝的抑制作用

2.3 杀菌剂对桉树焦枯病病原菌的EC50值比较

各药剂毒力方程、相关系数及EC50值见表5。表中不同杀菌剂对同一种桉树焦枯病病原菌的EC50差异很大，如Ca. cerciana能够被多菌灵、咪鲜胺、甲基硫菌灵有效抑制，但是对代森锰锌、百菌清和嘧菌酯不敏感；同一种杀菌剂对不同桉树焦枯病病原菌的EC50也存在差异，如嘧菌酯只能有效抑制菌株CMW 25283、CMW 25311(Ca. pauciramosa)菌丝生长，而对于其他菌株抑制效果不佳。根据EC50值判断，甲基硫菌灵对CMW25311(Ca. pauciramosa)的毒力最小(EC50值最大)；嘧菌酯对CMW 25311(Ca. pauciramosa)的毒力最大(EC50值最小)。综合比较分析，咪鲜胺对5种桉树焦枯病病原菌的EC50值普遍较小，能有效地抑制桉树焦枯病病原菌菌丝生长。

表5 6种杀菌剂对桉树焦枯病病原菌的毒力测定

续上表

3 结论和讨论

本研究采用6种杀菌剂对5种桉树焦枯病病原菌进行了室内毒力测定，结果表明不同杀菌剂对同种桉树焦枯病病原菌菌丝生长抑制作用差异显著，同种杀菌剂对不同桉树焦枯病病原菌的抑制作用也存在差异，因此需要针对各类焦枯病原菌筛选最佳杀菌剂进行化学防控。

此前对桉树焦枯病化学防控的研究是针对同一病原菌进行多种杀菌剂的抑制效果测试，本研究显示不同种桉树焦枯病病原菌对同种杀菌剂的敏感性存在显著差异，这进一步证明我国桉树焦枯病病原丽赤壳属真菌存在物种多样性。现今，苗圃或小面积桉树焦枯病主要采用化学防治方法，但是桉树焦枯病的病原菌存在物种多样性[2-3]，这无疑给桉树焦枯病的防治工作增加了难度。在实施桉树焦枯病的化学防控过程中，首先要确定发病区域病原菌种类，进而有针对性地选择效果最好的杀菌剂。

本试验表明，咪鲜胺对所有供试菌株的菌丝生长均有较好的抑制作用，是今后在生产上防治桉树焦枯病的潜力药剂。据报道，咪鲜胺已能够有效抑制桉树枝枯病(病原菌为Lasiodiplodia theobromae，Cryptospotiopsis sp.)[15]、核桃炭疽病(病原菌为Colletotrichum gloeosporioides)[16]、黄瓜靶斑病(病原菌为Corynespora cassiicola)[17]、苹果炭疽病(病原菌为 Colletotrichumg loeosporioides)[18]病原菌菌丝生长，目前已被广泛用于多种植物的多种病害防控。此外，防治桉树焦枯病也可用500倍代森锰锌有效成分稀释液与甲基硫菌灵或多菌灵混合使用，并与咪鲜胺轮换使用以有效控制病害发生。

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Laboratory Toxicity of Six Fungicides to Pathogens Cause Eucalyptus Leaf Blight Pathogens

LI Guo-qing1, CHEN Shuai-fei1,LIU Fei-fei1, ZHOU Xu-dong2, XIE Yao-jian1
(1. China Eucalypt Research Centre, Zhanjiang 524022, Guangdong, China；2. FuturaGene Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd, Shanghai 200235, China)

Eucalyptus leaf blight caused by Calonectria spp. is one of the most significant diseases of Eucalyptus worldw ide. In order to select effective fungicides to control the diseases caused by Calonectria spp. the toxicities of 6 fungicides (thiophanate-methyl, carbendazim, mancozeb, chlorothalonil, prochloraz, and azoxystrobin) to 5 Calonectria species (C. cerciana, C. crousiana, C. fujianensis, C. pauciramosa and C. pseudoreteaudii) were tested by evaluation of mycelial grow th post application. All 6 fungicides inhibited mycelial grow th of the 5 Calonectria species but to significantly different degrees. The inhibiting effect of different fungicides to the same species of Calonectria also proved significant, and differences were also found in the sensitivity of different Calonectria species to the same fungicide. In general, the fungicide prochloraz proved most efficient for inhibiting mycelial grow th of the 5 Calonectria species tested.

Eucalyptus; leaf blight; Calonectria; fungicide; toxicity

S763.15

A

2014-05-14

广东省林业科技创新专项“桉树重大病虫害控制技术研究与示范(2010KJCX015-03)；广东省自然科学基金“广东桉树焦枯病及无性系选择研究”(10145624536-400000)；国家国际科技合作专项项目“重要林业病害致病力及多样性研究”(2012DFG31830)

李国清(1988— )，在读硕士研究生，主要研究方向：森林病害

＊陈帅飞为通讯作者.E-mail:cerccsf@126.com