野生黄蝉兰多倍体诱导初报

王玉英等

摘要：以野生黄蝉兰无菌苗的丛生芽为供试材料，分别用浓度为0.008%、0.010%、0.030%、0.060%、0.120%、0150%、0.200%的秋水仙素对其处理24、48、72 h。结果表明，以0.06%秋水仙素处理72 h的诱导效果最佳，诱导变异率达62.5%，死亡率为22.5%；多倍体黄蝉兰材料在形态上出现叶色深绿、植株粗壮和叶片增厚等优良性状，同时气孔和染色体数目都有明显变化，可作为新材料加以利用。

关键词：野生黄蝉兰；秋水仙素；多倍体诱导

中图分类号： S682.310.36 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0132-03

收稿日期：2013-11-16

基金项目：国家自然科学基金（编号：30160074）；科技部成果转化项目（编号：2012GB2F300423）；云南省自然科学基金重点项目（编号：2002C0003P）；云南省重点新产品开发项目（编号：2012BB008）。

作者简介：王玉英（1980—），女，云南大理人，博士，讲师，主要从事植物资源的利用和创新研究。E-mail：wyysxp@126.com。

通信作者：李枝林，教授，主要从事观赏植物资源利用及创新研究。 E-mail：lzl-yn@sohu.com。黄蝉兰（Cymbidium iridioides D. Don）为兰科兰属大花亚属的植物。根据陈心启等的分类，大花亚属包括黄蝉兰、虎头兰、碧玉兰、长叶兰、沉香虎头兰、文山红柱兰等[1]。黄蝉兰属附生，假鳞茎椭圆状卵形至狭卵形，长4～11 cm、宽2～5 cm，总状花序，具3～17朵花；花苞片近三角形，长2～3 mm；花梗和子房长4.0～4.5 cm；花较大，直径达10 cm，有香气；花期8—12月，果期11月。它产于我国西南山区高海拔处，如云南贡山、福贡、盈江、腾冲、龙陵、德钦、临沧、云县、景东、勐海、建水、元阳、绿春、屏边、麻栗坡、砚山等地，附生于海拔750～2 500 m的常绿阔叶林中的树上或岩石上，分布于我国西藏东南部（察隅）、四川西南部以及尼泊尔、不丹、锡金、印度东北部、缅甸北部。它与虎头兰的最大区别是花期不同，虎头兰一般在1月左右开花，黄蝉兰花形较虎头兰严整，花色、花朵与虎头兰相似[2]。该类兰以其花色基调不同又可分为黄蝉兰、青蝉兰、红蝉兰和朱砂蝉兰，较适合作育种亲本或切花材料，具有较高的应用价值和开发价值。

兰花生长周期长，繁殖系数低，在育种过程造成了相当程度的阻力。近年来，利用多倍体育种已培育出许多兰花新品种。通常多倍体植物具有植株粗壮、花朵硕大、花色艳丽、叶质增宽增厚、适应性增强及次生代谢物积累量高等特点。秋水仙素诱变的多倍体有四倍体、六倍体、八倍体等[3]。目前，已有春兰[4]、沉香虎头兰[5]、墨兰× 大花蕙兰的F1代[6]、素心黄[7]、寒兰[8]、杂交兰根状茎[3]、大花蕙兰红宝石原球茎[9]和野生碧玉兰[10]等兰属植物多倍体诱导的报道，而野生黄蝉兰的倍性育种尚未见报道。本研究建立在组织培养的基础上，通过秋水仙素诱导形成多倍体植株，以期为黄蝉兰多倍体育种提供科学依据和技术基础。

1材料与方法

1.1材料

野生黄蝉兰收集于云南省文山州马关县，并在云南农业大学花卉研究所兰花资源圃中驯化栽培2年以上；选用前期研究培养出的种子无菌萌发试管苗，以后代遗传性状稳定的丛芽作为供试材料。试验于2010年在云南农业大学花卉研究所实验室内进行。

1.2方法

1.2.1多倍体的诱导配制浓度为0.008%、0.010%、0030%、0.060%、0.120%、0.150%、0.200%的秋水仙素溶液，高压灭菌。取健康、长势相对一致的新生丛生芽，在无菌条件下浸泡在经灭菌的秋水仙素溶液中，分别处理24、48、72 h。处理后用无菌水冲洗3～4次，在无菌的滤纸上吸干水分，转入最佳复壮培养基（1/2MS+2.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+8%香蕉泥，pH值5.8）上，于（25±1） ℃下光照培养，处理40 d观察苗体的死亡情况，处理90 d观察苗体的变异情况，每隔50 d转接1次，进行相关统计。

1.2.2多倍体的鉴定

1.2.2.1形态学观察根据多倍体植株与二倍体植株在叶形、叶色、株形、株色、生长势上呈现出的差异，对变异植株进行初选。对黄蝉兰叶的长与宽进行测量，各检测20株。

1.2.2.2气孔鉴定气孔大小与植株倍性呈正相关，气孔密度与植株倍性呈负相关，以该特性作为多倍体初步鉴定的方法之一。取二倍体植株和变异植株叶片，平均分成上、中、下3个部分，撕取叶片下表皮，在显微镜下观察。采用目镜测微尺测定气孔的长径、短径，用椭圆面积近似公式（S=长径×短径）计算气孔的面积，各检测30个。

1.2.2.3染色体鉴定兰科植物具有粗大的根系，根被厚厚的海绵状的白色根被所覆盖，中央有1个维管组织的髓部。根据该特点采用以下制片方案。

取材时间和取材部位：根据经验，09：50—10：15取材染色体中期分裂较旺盛。取材部位为健壮植株刚刚长出根的幼嫩根尖组织。（1）预处理液的比较。将取出的长度为0.5 cm的根尖放入口径为5 cm的小瓶中，分别加入0.002 mol/L 8-羟基喹啉和0.1%秋水仙素2种预处理液，于常温下预处理7 h左右，洗涤后转入Caronys液（乙醇与乙酸体积比3 ∶1）中，置于冰水中固定半小时，取出瓶后放入60 ℃ 1 mol/L HCl中水解6 min。水解时间过长，细胞质不着色，染色体染色较浅，只有在水解时间适宜时才可获得染色体呈深红色或紫红色，细胞质无色或只有极浅淡的红色[11]。（2）染色。用蒸馏水清洗3～5次解离过的材料（如果清洗不干净，则染色效果较差，影响拍摄效果），按材料的多少，加入一定量的卡宝品红液，直到淹没瓶中的根尖，约半小时后便可压片。（3）压片。采用常规压片法，取处理过的根尖于载玻片上，滴1滴卡宝品红液，盖上盖玻片，用解剖针轻敲大团根尖，使其分散，再用叠好的滤纸按住盖玻片的对角，用橡皮头轻敲团状物，使细胞均匀分散，将滤纸放在盖玻片上，用拇指紧按住滤纸一端，另一拇指垂直地按住盖玻片，以使细胞平整。（4）镜检。将做好的切片放于B203/B203LED型双目生物显微镜下观察染色体分散情况，记录并摄像。endprint

2结果与分析

2.1不同秋水仙素浓度和处理时间诱变黄蝉兰的效果

3结论与讨论

秋水仙素对细胞有毒害作用，经其处理的材料前期生长缓慢，这种毒害作用随着处理浓度的增加或时间的延长而加剧，从而使细胞死亡率增加。因此，要掌握合适的处理浓度和时间才能获得最好的加倍效果。李涵等对沉香虎头兰新幼芽进行多倍体诱导，发现0.05%秋水仙素处理72 h效果最好，变异率为74%，死亡率为20%[5]。李雪娇等对碧玉兰丛生芽进行多倍体诱导，发现0.04%秋水仙素处理72 h效果最好，诱导变异率达60%，死亡率为30%[10]。尹翠翠等对杂交兰F1代的根状茎进行诱导，发现0.10%秋水仙素处理48h诱导效果最佳，变异率为36%，死亡率为8%[3]。本研究结果表明，用0.060%秋水仙素处理72 h对黄蝉兰的诱导效果最佳，变异率高达62.5%，死亡率仅为22.5%，说明秋水仙素能有效诱导黄蝉兰多倍体。

在植物组织器官发育过程中，具有分裂功能的体细胞受到秋水仙素等化学处理或光、热等物理处理或自然环境的变化，都可促使部分细胞突变，这种变异细胞和未突变的正常细胞可以形成一个共同的植物生长点原基，进而形成特有的植物嵌合体现象[12]。Norris等在试验中发现，嵌合体中不同层次的细胞在培养过程中可以共同发育成一个生长原基，从而实现母体型嵌合体的复制，但在大多数情况下，通过组织培养进行不断分离纯化获得的嵌合体株率是很低的[13]。不同诱导材料对秋水仙素的敏感程度有较大差异[11]。郑思乡等用秋水仙素处理苎麻的丛生芽，获得94%四倍体[14]。本研究将变异材料的丛芽进行不断的分离纯化，从而获得较高概率的四倍体植株，且在后代中表现稳定。

参考文献：

[1]陈心启，吉占和. 中国兰花全书[M]. 北京：中国林业出版社，1997：80.

[2]陈心启. 中国植物志：第十八卷[M]. 北京：科学出版社，1999：202.

[3]尹翠翠，张燕，张景华，等. 秋水仙素诱导杂交兰四倍体及倍性鉴定[J]. 核农学报，2010，24（3）：518-521.

[4]林芬，邓国础.春兰人工诱变的研究[J]. 湖南农业大学学报，1997，3（4）：39-43.

[5]李涵，龙春林，郑思乡，等. 沉香虎头兰多倍体诱导及其鉴定[J]. 园艺学报，2005，32（5）：853-853.

[6]张志胜，谢利，萧爱兴，等. 秋水仙素处理兰花原球茎对其生长和诱变效应的影响[J]. 核农学报，2005，19（1）：19-23.

[7]邓樱，周晔，陈继敏. 秋水仙素诱导兰属“素心黄”多倍体的方法研究[J]. 亚热带植物科学，2008，37（2）：38-40.

[8]Kim M，Yang W J，Hoon S C，et al. Polyploidy induction of Cymbidium kanran by treatment of colchicine in vitro[J]. Journal of Horticulture Science，1997，39（1）：73-76

[9]杨丽娟，高素萍，邹宗兰. 秋水仙素离体诱导大花蕙兰多倍体试验[J]. 中国种业，2008（12）：60-61.

[10]李雪娇，李枝林，黄丽萍. 野生碧玉兰多倍体诱导及鉴定[J]. 中国农学通报，2010，26（13）：261-266.

[11]谭德冠，庄南生，黄华孙. 组织培养与秋水仙碱诱导相结合培育植物多倍体的应用[J]. 亚热带植物科学，2005，34（1）：77-80.

[12]李明银，何云晓. 植物遗传嵌合体及其在观赏植物育种中的应用[J]. 植物学通报，2005，22（6）：641-647.

[13]Norris R E，Smith R H，Vaughn K C. Plant chimeras used to establish the de novo origin of shoots[J]. Science，1983，220（4592）：75-76.

[14]郑思乡，罗慧敏，董延瑜，等. 组织培养在苎麻多倍体研究中的应用初报[J]. 湖南农业大学学报，1995，21（4）：361-365.endprint

2结果与分析

2.1不同秋水仙素浓度和处理时间诱变黄蝉兰的效果

3结论与讨论

秋水仙素对细胞有毒害作用，经其处理的材料前期生长缓慢，这种毒害作用随着处理浓度的增加或时间的延长而加剧，从而使细胞死亡率增加。因此，要掌握合适的处理浓度和时间才能获得最好的加倍效果。李涵等对沉香虎头兰新幼芽进行多倍体诱导，发现0.05%秋水仙素处理72 h效果最好，变异率为74%，死亡率为20%[5]。李雪娇等对碧玉兰丛生芽进行多倍体诱导，发现0.04%秋水仙素处理72 h效果最好，诱导变异率达60%，死亡率为30%[10]。尹翠翠等对杂交兰F1代的根状茎进行诱导，发现0.10%秋水仙素处理48h诱导效果最佳，变异率为36%，死亡率为8%[3]。本研究结果表明，用0.060%秋水仙素处理72 h对黄蝉兰的诱导效果最佳，变异率高达62.5%，死亡率仅为22.5%，说明秋水仙素能有效诱导黄蝉兰多倍体。

在植物组织器官发育过程中，具有分裂功能的体细胞受到秋水仙素等化学处理或光、热等物理处理或自然环境的变化，都可促使部分细胞突变，这种变异细胞和未突变的正常细胞可以形成一个共同的植物生长点原基，进而形成特有的植物嵌合体现象[12]。Norris等在试验中发现，嵌合体中不同层次的细胞在培养过程中可以共同发育成一个生长原基，从而实现母体型嵌合体的复制，但在大多数情况下，通过组织培养进行不断分离纯化获得的嵌合体株率是很低的[13]。不同诱导材料对秋水仙素的敏感程度有较大差异[11]。郑思乡等用秋水仙素处理苎麻的丛生芽，获得94%四倍体[14]。本研究将变异材料的丛芽进行不断的分离纯化，从而获得较高概率的四倍体植株，且在后代中表现稳定。

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[14]郑思乡，罗慧敏，董延瑜，等. 组织培养在苎麻多倍体研究中的应用初报[J]. 湖南农业大学学报，1995，21（4）：361-365.endprint

2结果与分析

2.1不同秋水仙素浓度和处理时间诱变黄蝉兰的效果

3结论与讨论

秋水仙素对细胞有毒害作用，经其处理的材料前期生长缓慢，这种毒害作用随着处理浓度的增加或时间的延长而加剧，从而使细胞死亡率增加。因此，要掌握合适的处理浓度和时间才能获得最好的加倍效果。李涵等对沉香虎头兰新幼芽进行多倍体诱导，发现0.05%秋水仙素处理72 h效果最好，变异率为74%，死亡率为20%[5]。李雪娇等对碧玉兰丛生芽进行多倍体诱导，发现0.04%秋水仙素处理72 h效果最好，诱导变异率达60%，死亡率为30%[10]。尹翠翠等对杂交兰F1代的根状茎进行诱导，发现0.10%秋水仙素处理48h诱导效果最佳，变异率为36%，死亡率为8%[3]。本研究结果表明，用0.060%秋水仙素处理72 h对黄蝉兰的诱导效果最佳，变异率高达62.5%，死亡率仅为22.5%，说明秋水仙素能有效诱导黄蝉兰多倍体。

在植物组织器官发育过程中，具有分裂功能的体细胞受到秋水仙素等化学处理或光、热等物理处理或自然环境的变化，都可促使部分细胞突变，这种变异细胞和未突变的正常细胞可以形成一个共同的植物生长点原基，进而形成特有的植物嵌合体现象[12]。Norris等在试验中发现，嵌合体中不同层次的细胞在培养过程中可以共同发育成一个生长原基，从而实现母体型嵌合体的复制，但在大多数情况下，通过组织培养进行不断分离纯化获得的嵌合体株率是很低的[13]。不同诱导材料对秋水仙素的敏感程度有较大差异[11]。郑思乡等用秋水仙素处理苎麻的丛生芽，获得94%四倍体[14]。本研究将变异材料的丛芽进行不断的分离纯化，从而获得较高概率的四倍体植株，且在后代中表现稳定。

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[8]Kim M，Yang W J，Hoon S C，et al. Polyploidy induction of Cymbidium kanran by treatment of colchicine in vitro[J]. Journal of Horticulture Science，1997，39（1）：73-76

[9]杨丽娟，高素萍，邹宗兰. 秋水仙素离体诱导大花蕙兰多倍体试验[J]. 中国种业，2008（12）：60-61.

[10]李雪娇，李枝林，黄丽萍. 野生碧玉兰多倍体诱导及鉴定[J]. 中国农学通报，2010，26（13）：261-266.

[11]谭德冠，庄南生，黄华孙. 组织培养与秋水仙碱诱导相结合培育植物多倍体的应用[J]. 亚热带植物科学，2005，34（1）：77-80.

[12]李明银，何云晓. 植物遗传嵌合体及其在观赏植物育种中的应用[J]. 植物学通报，2005，22（6）：641-647.

[13]Norris R E，Smith R H，Vaughn K C. Plant chimeras used to establish the de novo origin of shoots[J]. Science，1983，220（4592）：75-76.

[14]郑思乡，罗慧敏，董延瑜，等. 组织培养在苎麻多倍体研究中的应用初报[J]. 湖南农业大学学报，1995，21（4）：361-365.endprint