HPLC 法测定菊花七味胶囊中胆红素的含量

王文忠 孙 瑛 何春龙 李树明

(1.内蒙古第三医院，内蒙古 呼和浩特 010010; 2.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110)

菊花七味胶囊是《中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》(1998 年版)收载品种，蒙药名为乌达巴拉-7，由菊花、人工牛黄、五灵脂、石膏、红花、麦冬、苦参7 味药材组成，具有凉血清“协日”用于胃“协日”胃酸口苦食欲不振血热头痛［1］。人工牛黄是菊花七味胶囊的主要成分之一，具有清热解毒，祛痰利咽的功能。而胆红素是人工牛黄的主要化学成分。由于原标准中没有收载相关定性定量指标，故参考文献［2-8］采用高效液相色谱法测定菊花七味胶囊中人工牛黄中的胆红素含量，可为该药质量标准的提高提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器: 岛津LC -20A 高效液相色谱仪;色谱柱: 依利特C18 柱(5μm，4.6mm x250mm);KQ5200E 型超声仪(功率200W，频率40KHz);电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司，0.0001g)。

1.2 试剂与药品: 胆红素对照品(中国食品药品检定研究院，批号: 100077 -200805，供含量测定用);菊花七味胶囊(呼和浩特中蒙医院，批号: 140217、140321;实验室自制，批号: 130910;)甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件: 色谱柱: 依利特C18 柱(250mm ×4.6mm，5μm);流动相: 甲醇-三氯甲烷-l%磷酸溶液(72: 25: 3);检测波长: 450nm;流速: 1.0mL·min-1;柱温: 25℃;理论板数: 按胆红素色谱峰计算应不低于2000。

2.2 溶液的制备: 对照品溶液的制备: 精密称取胆红素对照品5mg，置100mL 棕色容量瓶中，加三氯甲烷制成50μg﹒mL-1的溶液，作为对照品储备液。取对照品储备液20mL 置于100mL 棕色容量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，配制成10μg﹒mL-1对照品溶液。

供试品溶液的制备: 取菊花七味胶囊内容物0.12g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入三氯甲烷-甲醇-盐酸-水(400: 98: 0.3: 1. 7)混合溶液10mL，称定重量，超声处理30min，放冷，称定重量，用上述溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。

阴性样品溶液的制备: 按照处方称取除人工牛黄外的其他药材，按照制备供试品溶液的方法制备阴性样品溶液。

2.3 专属性试验: 分别吸取供试品溶液、对照品溶液及阴性样品溶液各10μL，按“2.1”色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，胆红素与其他组分色谱峰可基线分离，分离度符合规定，且阴性样品无干扰。色谱图见图1。

2.4 线性范围: 精密吸取胆红素对照品储备液(50μg ﹒mL-1)0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、6.0mL，分别置于10mL 棕色容量瓶中，用三氯甲烷定容至刻度，摇匀，分别制成含胆红素1、2、5、10、20、30μg ﹒ mL-1的溶液。按照“2.1”色谱条件，分别吸取10μL 进样，测定峰面积，以浓度C(μg ﹒mL-1)为横坐标，峰面积A 为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为A=39007C+5636.5，r =0.9993，结果显示: 胆红素在1.0μg ﹒ mL-1～30μg ﹒ mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验: 分别精密吸取供试品溶液(批号: 130910)与对照品溶液(10μg ﹒ mL-1)各10μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6 针，分别测定峰面积，结果供试品溶液RSD 为1.38%;对照品溶液的RSD 为1.61%。结果表明: 该方法精密度良好，符合含量测定要求。

2.6 稳定性试验: 取供试品(批号: 130910)溶液，分别于0、2、4、6、8 及10h 进样，各进样10μL，测定峰面积，RSD 为1.41%。结果表明: 供试品溶液在10h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验: 取供试品(批号: 130910)约0.12g，精密称定6 份。分别按“2.2”方法制备供试品溶液，各精密吸取10μL，注入高效液相色谱仪。测定峰面积，并计算含量，结果胆红素平均含量为0.9062mg ﹒ g-1，RSD 为1.35%。结果表明: 该方法的重复性良好，符合含量测定要求。

2.8 回收率试验: 取已知含量供试品粉末(批号: 130910)约0.06g，精密称定，共6 份，置于具塞锥形瓶中，每份精密加入胆红素对照品一定量。分别按“2.2”方法制备供试品溶液，各精密吸取10μL，注入高效液相色谱仪，测定含量，计算回收率。结果平均回收率为97.50%，RSD 为1.85%。结果表明: 该方法的准确度良好，符合含量测定要求。见表1。

表1 加样回收试验结果

2.9 供试品含量测定: 取不同批号的供试品约0.12g，精密称定，各两份，分别按“2.2”方法制备供试品溶液，各吸取溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，计算胆红素的含量。按照《中国药典》2010 版一部的规定，人工牛黄中含胆红素不得低于0.63%计算，菊花七味胶囊中胆红素含量应不得低于0.7269mg·g-1。测定结果见表2。

表2 含量测定结果

3 讨 论

3.1 提取时间的选择: 实验对超声提取的时间进行了考察，比较了20min、30min 和40min，实验结果显示，超声30min 提取效果最好。

3.2 流动相的选择: 通过参考文献，比较了不同的流动相: 甲醇: 乙睛: l % 冰乙酸(88 : 10 : 2 );甲醇: 三氯甲烷: 1%磷酸溶液(81: 13: 6);甲醇: 三氯甲烷: 1%磷酸溶液(72: 25: 3);结果表明: 用甲醇: 三氯甲烷: 1%磷酸溶液(72: 25: 3)为流动相保留时间适宜，分离效果好。

3.3 研究展望: 本实验以人工牛黄中胆红素为研究对象进行含量测定，为了更加全面的提高该药的质量标准，有待于进一步对其他组分进行综合研究，必要时可对菊花七味胶囊进行指纹图谱的研究。

［1］中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药标准［S］.1998.175.

［2］国家药典委员会. 中国药典［S］.一部.2010: 5 -6.

［3］谢忱，刘殿奎，常岚，等. HPLC 法测定蒙药那如-5 胆红素含量［J］.中国民族医药杂志，2011，(4): 64.

［4］丘振文，钟瑜，罗丹冬，等.高效液相色谱法测定解毒西黄丸中人工牛黄的胆红素含量［J］. 中药新药与 临床药理，2011，22(6): 666 -668.

［5］吴红霞，付锦光.高效液相色谱法测定西黄片中人工牛黄的胆红素含量［J］.当代医学，2009(4): 39 -41.

［6］李瑞萍，白音夫，赵阳，等. HPLC 测定蒙药三臣丸胆红素含量［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(6): 112 -113.

［7］邓群英，曾凡红，齐皓，等.高效液相法测定牛黄上清片中胆红素的含量［J］.健康必读，2011(8): 26 -28.

［8］吴琳，陈国章.高效液相色谱法测定氯芬黄敏片中胆红素含量［J］.中国药业，2009，18(10): 48 -49.