p53在骨关节炎软骨组织中的表达及与关节软骨细胞自噬的关系研究

张志宇+许珂+王静+许鹏

【摘要】 目的：研究p53在骨关节炎软骨组织中的表达及与关节软骨细胞自噬的关系。方法：对20例骨关节炎患者（OA组）及10例正常膝关节软骨组织（对照组），用实时定量PCR（real-time PCR）、免疫组化等方法检测p53及Beclin1在膝关节软骨中的表达与分布，并对两者进行相关性分析。结果：p53在OA组的表达明显高于正常对照组（P<0.05），OA组关节软骨组织中Beclin1的表达量明显低于正常对照组（P<0.01），p53与Beclin1在软骨组织中表达呈负性相关（r=-0.629，P<0.05）。结论：骨关节炎中p53的高表达能够抑制软骨细胞自噬，从而减弱软骨细胞对凋亡抵抗能力，促进软骨细胞凋亡。

【关键词】 骨关节炎； 自噬； p53； Beclin1

骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性退行性关节病，其主要病理改变是关节软骨细胞的减少和软骨基质的降解，是致残致畸的主要原因之一[1]。OA软骨细胞的减少主要由于软骨细胞过度凋亡引起，引起OA软骨细胞过度凋亡的原因一直是近年来的研究热点。随着自噬现象的发现及其与凋亡关系研究的不断深入，有学者发现自噬在OA软骨细胞中减弱，从而促进凋亡，但OA软骨细胞自噬减弱的原因并不清楚[2]。最新研究认为，抑癌基因p53是调控细胞凋亡和自噬的重要因子[3]。因此，本研究通过检测p53及自噬调节因子Beclin1在OA软骨细胞中的表达，探索OA软骨细胞自噬减弱的原因，为OA的基础及临床研究提供新的方向及思路，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从2012年11月-2013年4月在西安交通大学医学院附属红会医院住院预接受膝关节置换手术治疗患者中，根据根据美国风湿病学会（ACR）2008年修订的OA诊断标准，通过病史、临床检查和X线平片等确诊OA患者共20例作为OA组。其中男6例，女14例，平均年龄（71.3±8.9）岁。同时收集无关节疾病史及肉眼病变的因外伤截肢、交叉韧带断裂、半月板损伤等行手术治疗的膝关节患者共10例作为对照组，其中男8例，女2例，平均年龄（42.4±6.7）岁，经病理学诊断关节病变，作为正常对照组。受试者均知情同意参加本实验并经过医学伦理委员会批准。两组受试者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要试剂及方法

1.2.1 主要试剂 p53及Beclin1引物由南京金斯瑞公司合成，引物信息见表1；逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas公司；SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ购自日本Takara公司；p53及Beclin1多克隆抗体购自中国台湾Abnova公司，即用SP免疫组化两步法检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 方法 30例新鲜标分为两部分：一部分立即放入4%多聚甲醛中固定，10%EDTA脱钙6、7周，常规脱水，石蜡包埋，以4～5 μm厚度连续切片。行常规HE染色外，按试剂盒内说明分别行p53及Beclin1免疫组织化学染色，用已知的阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照，经染色后，阳性信号呈黄褐色。每张切片随机选取5个高倍视野（×200），计算阳性染色细胞所占细胞总数的百分比；另一部分放入1‰DEPC水处理过的冻存管中浸液氮24 h后，转移到-80 ℃冻存，Trizol法提取软骨组织总RNA，经微量核酸/蛋白定量仪鉴定并定量后，根据Fermentas公司提供说明书进行逆转录，对逆转录产物进行扩增，反应结束后，立即进行熔解曲线分析，用于判定PCR反应的特异性，是否有非特异性扩增产物；琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物条带是否单一；内参照为β-actin，基因表达量采用ΔΔCt法进行计算。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，对数据进行方差齐性及正态性检验后，根据情况，两组间均数的比较用Mann-Whitney U检验或t检验；OA软骨细胞中p53与Beclin1基因水平表达量用Pearson或Spearman检验进行相关性分析以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE及免疫组织化学染色结果 20例OA组与10例对照组的膝关节软骨组织经HE染色后比较软骨组织的厚度、形态及软骨细胞的数量可见：OA软骨变薄、缺损，软骨表面毛糙，软骨细胞数量减少，呈簇状生长（见图1A、B）。OA关节软骨中p53阳性细胞主要分布于表层和中层，细胞质及细胞核均有表达；对照组关节软骨阳性细胞分布部位与OA相似，但数量少，阳性细胞数低，两组间差异有统计学意义（P<0.05），见图1C、D、图2。OA关节软骨四层结构中均可见到Beclin1阳性细胞分布，主要表达于细胞质；对照组关节软骨阳性细胞分布部位与OA相似，但数量较多，阳性细胞数高，两组间差异有统计学意义（P<0.01），见图1E、F、图2。

2.2 real time PCR结果 用realtime qPCR的方法检测p53及Beclin1的表达，β-actin作为内参照。结果显示p53在OA患者的关节软骨组织中表达显著高于对照组（P<0.01），而Beclin1在OA患者的关节软骨组织中表达显著低于对照组（P<0.01），见图3。

2.3 相关性分析结果 OA患者20例关节软骨组织中p53及Beclin1基因的表达进行相关性分析，得出r=-0.629（P<0.05），故认为OA组织中p53及Beclin1基因的表达之间具有相关性，且呈负相关，见图4。

3 讨论

OA软骨细胞的减少主要由于软骨细胞过度凋亡引起[4]。Gobbi等[5]发现在OA膝关节软骨的表层和中层有过度的细胞凋亡。应用TUNEL法和荧光标记的钙依赖性的磷脂结合蛋白V法检测正常组和OA组的髋关节软骨发现，在OA的关节软骨中有18%～21%的软骨细胞出现凋亡的特征，而只有2%～5%有凋亡特征的软骨细胞出现在正常组关节软骨中[6]。

OA软骨细胞过度凋亡与凋亡基因过度表达有关[7]。p53是重要的抑癌基因，在转录水平上调促凋亡基因如Bax、PUMA和NOXA，下调凋亡抑制基因如Bcl-2的表达[8]。细胞质中的p53使 Bax诱导的MOMP增加[9]。NO表达增加、细胞外基质降解可以增加软骨细胞中p53的表达，进而诱导软骨细胞凋亡[10]。本研究也证实OA中p53无论在基因水平及蛋白表达水平均高于正常对照组，且主要分布在表层和中层，细胞质与细胞核均有表达。

研究发现，自噬参与了OA软骨细胞凋亡的调节。自噬通过降解蛋白及残余细胞器为细胞节约并提供能量，清除某些有害的蛋白来防止或减少由这些聚集蛋白所引起的细胞毒性，中和细胞的应激反应[11]。Beclin1是重要的自噬调节基因，它与Vps34形成的复合物可使磷脂酰肌醇磷酸化形成PI3P。PI3P招募并引导自噬相关蛋白定位，进而介导自噬体的成核[12]。在OA大鼠模型的研究中发现自噬标记物LC3Ⅱ与Caspase3表达分布相反[13]。在OA患者的软骨组织中研究发现，随着疾病严重程度的增加Beclin1介导的自吞噬途径逐渐减弱，且与软骨细胞凋亡呈负相关[2]。自噬是保证关节软骨细胞获取ATP、中和应激的重要手段，因此自噬被抑制使得软骨细胞抵抗凋亡刺激的能力下降。

近年研究发现，p53不仅可以促进凋亡，也能调节自噬。肿瘤自噬的研究中发现，细胞质中的p53可抑制Beclin1介导的自噬，因此当物质和能量缺乏时，虽然p53表达降低，但细胞为维持ATP水平自噬不仅没有减弱反而增强[3]。本研究在OA软骨细胞中也证实p53与Beclin1基因表达呈负相关，说明关节软骨中p53可能抑制了Beclin1介导的自噬反应，进而使得OA软骨细胞更易发生凋亡。

综上所述，由于OA中由于NO表达增加、细胞外基质降解等损伤因子增加，导致OA软骨细胞p53表达增加，除了直接诱导凋亡外，还可使Beclin1介导的自噬水平降低，从而削弱自噬对软骨细胞保护作用（如提供ATP、中和应激反应等），进一步加剧OA软骨细胞的凋亡。中止或者减弱这一过程，可能对减少OA细胞凋亡，甚至延缓OA软骨退变的进展，具有一定积极的意义。但OA软骨细胞中p53抑制Beclin1的具体机制还须进一步在细胞水平及分子水平进行研究。

参考文献

[1]许珂，许鹏.骨关节炎软骨细胞死亡机制研究[J].中华风湿病学杂志，2011，15（4）：271-274.

[2] Caramés B，Taniguchi N，Otsuki S，et al.Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage，and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis[J].Arthritis & Rheumatism，2010，62（3）：791-801.

[3] Tasdemir E，Maiuri M C，Galluzzi L，et al.Regulation of autophagy by cytoplasmic p53[J].Nat Cell Biol，2008，10（6）：676-687.

[4] Abramson S B，Attur M.Developments in the scientific understanding of osteoarthritis[J].Arthritis Res Ther，2009，11（3）：227.

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[6] Heraud F，Heraud A，Harmand M F.Apoptosis in normal and osteoarthritic human articular cartilage[J].Ann Rheum Dis，2000，59（12）：959-965.

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[8] Follis A V，Chipuk J E，Fisher J C，et al.PUMA binding induces partial unfolding within BCL-xL to disrupt p53 binding and promote apoptosis[J].Nat Chem Biol，2013，9（3）：163-168.

[9] Montero J，Dutta C，van Bodegom D，et al.p53 regulates a non-apoptotic death induced by ROS[J].Cell Death Differ，2013，20（11）：1465-1474.

[10]Lundgreen K，Lian ?，Scott A，et al.Increased levels of apoptosis and p53 in partial-thickness supraspinatus tendon tears[J].Knee Surgery，Sports Traumatology，Arthroscopy，2013，21（7）：1636-1641.

[11] Dalby K N，Tekedereli I，Lopez-Berestein G，et al.Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer[J].Autophagy，2010，6（3）：322-329.

[12] Vergne I，Deretic V.The role of PI3P phosphatases in the regulation of autophagy[J].Febs Lett，2010，584（7）：1313-1318.

[13] Almonte-Becerril M，Navarro-Garcia F，Gonzalez-Robles A，et al.Cell death of chondrocytes is a combination between apoptosis and autophagy during the pathogenesis of osteoarthritis within an experimental model[J].Apoptosis，2010，15（5）：631-638.

（收稿日期：2014-03-17） （本文编辑：欧丽）

OA软骨细胞过度凋亡与凋亡基因过度表达有关[7]。p53是重要的抑癌基因，在转录水平上调促凋亡基因如Bax、PUMA和NOXA，下调凋亡抑制基因如Bcl-2的表达[8]。细胞质中的p53使 Bax诱导的MOMP增加[9]。NO表达增加、细胞外基质降解可以增加软骨细胞中p53的表达，进而诱导软骨细胞凋亡[10]。本研究也证实OA中p53无论在基因水平及蛋白表达水平均高于正常对照组，且主要分布在表层和中层，细胞质与细胞核均有表达。

研究发现，自噬参与了OA软骨细胞凋亡的调节。自噬通过降解蛋白及残余细胞器为细胞节约并提供能量，清除某些有害的蛋白来防止或减少由这些聚集蛋白所引起的细胞毒性，中和细胞的应激反应[11]。Beclin1是重要的自噬调节基因，它与Vps34形成的复合物可使磷脂酰肌醇磷酸化形成PI3P。PI3P招募并引导自噬相关蛋白定位，进而介导自噬体的成核[12]。在OA大鼠模型的研究中发现自噬标记物LC3Ⅱ与Caspase3表达分布相反[13]。在OA患者的软骨组织中研究发现，随着疾病严重程度的增加Beclin1介导的自吞噬途径逐渐减弱，且与软骨细胞凋亡呈负相关[2]。自噬是保证关节软骨细胞获取ATP、中和应激的重要手段，因此自噬被抑制使得软骨细胞抵抗凋亡刺激的能力下降。

近年研究发现，p53不仅可以促进凋亡，也能调节自噬。肿瘤自噬的研究中发现，细胞质中的p53可抑制Beclin1介导的自噬，因此当物质和能量缺乏时，虽然p53表达降低，但细胞为维持ATP水平自噬不仅没有减弱反而增强[3]。本研究在OA软骨细胞中也证实p53与Beclin1基因表达呈负相关，说明关节软骨中p53可能抑制了Beclin1介导的自噬反应，进而使得OA软骨细胞更易发生凋亡。

综上所述，由于OA中由于NO表达增加、细胞外基质降解等损伤因子增加，导致OA软骨细胞p53表达增加，除了直接诱导凋亡外，还可使Beclin1介导的自噬水平降低，从而削弱自噬对软骨细胞保护作用（如提供ATP、中和应激反应等），进一步加剧OA软骨细胞的凋亡。中止或者减弱这一过程，可能对减少OA细胞凋亡，甚至延缓OA软骨退变的进展，具有一定积极的意义。但OA软骨细胞中p53抑制Beclin1的具体机制还须进一步在细胞水平及分子水平进行研究。

参考文献

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[11] Dalby K N，Tekedereli I，Lopez-Berestein G，et al.Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer[J].Autophagy，2010，6（3）：322-329.

[12] Vergne I，Deretic V.The role of PI3P phosphatases in the regulation of autophagy[J].Febs Lett，2010，584（7）：1313-1318.

[13] Almonte-Becerril M，Navarro-Garcia F，Gonzalez-Robles A，et al.Cell death of chondrocytes is a combination between apoptosis and autophagy during the pathogenesis of osteoarthritis within an experimental model[J].Apoptosis，2010，15（5）：631-638.

（收稿日期：2014-03-17） （本文编辑：欧丽）

OA软骨细胞过度凋亡与凋亡基因过度表达有关[7]。p53是重要的抑癌基因，在转录水平上调促凋亡基因如Bax、PUMA和NOXA，下调凋亡抑制基因如Bcl-2的表达[8]。细胞质中的p53使 Bax诱导的MOMP增加[9]。NO表达增加、细胞外基质降解可以增加软骨细胞中p53的表达，进而诱导软骨细胞凋亡[10]。本研究也证实OA中p53无论在基因水平及蛋白表达水平均高于正常对照组，且主要分布在表层和中层，细胞质与细胞核均有表达。

研究发现，自噬参与了OA软骨细胞凋亡的调节。自噬通过降解蛋白及残余细胞器为细胞节约并提供能量，清除某些有害的蛋白来防止或减少由这些聚集蛋白所引起的细胞毒性，中和细胞的应激反应[11]。Beclin1是重要的自噬调节基因，它与Vps34形成的复合物可使磷脂酰肌醇磷酸化形成PI3P。PI3P招募并引导自噬相关蛋白定位，进而介导自噬体的成核[12]。在OA大鼠模型的研究中发现自噬标记物LC3Ⅱ与Caspase3表达分布相反[13]。在OA患者的软骨组织中研究发现，随着疾病严重程度的增加Beclin1介导的自吞噬途径逐渐减弱，且与软骨细胞凋亡呈负相关[2]。自噬是保证关节软骨细胞获取ATP、中和应激的重要手段，因此自噬被抑制使得软骨细胞抵抗凋亡刺激的能力下降。

近年研究发现，p53不仅可以促进凋亡，也能调节自噬。肿瘤自噬的研究中发现，细胞质中的p53可抑制Beclin1介导的自噬，因此当物质和能量缺乏时，虽然p53表达降低，但细胞为维持ATP水平自噬不仅没有减弱反而增强[3]。本研究在OA软骨细胞中也证实p53与Beclin1基因表达呈负相关，说明关节软骨中p53可能抑制了Beclin1介导的自噬反应，进而使得OA软骨细胞更易发生凋亡。

综上所述，由于OA中由于NO表达增加、细胞外基质降解等损伤因子增加，导致OA软骨细胞p53表达增加，除了直接诱导凋亡外，还可使Beclin1介导的自噬水平降低，从而削弱自噬对软骨细胞保护作用（如提供ATP、中和应激反应等），进一步加剧OA软骨细胞的凋亡。中止或者减弱这一过程，可能对减少OA细胞凋亡，甚至延缓OA软骨退变的进展，具有一定积极的意义。但OA软骨细胞中p53抑制Beclin1的具体机制还须进一步在细胞水平及分子水平进行研究。

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[7] Kim J，Xu M，Xo R，et al.Mitochondrial DNA damage is involved in apoptosis caused by pro-inflammatory cytokines in human OA chondrocytes[J].Osteoarthritis and Cartilage，2010，18（3）：424-432.

[8] Follis A V，Chipuk J E，Fisher J C，et al.PUMA binding induces partial unfolding within BCL-xL to disrupt p53 binding and promote apoptosis[J].Nat Chem Biol，2013，9（3）：163-168.

[9] Montero J，Dutta C，van Bodegom D，et al.p53 regulates a non-apoptotic death induced by ROS[J].Cell Death Differ，2013，20（11）：1465-1474.

[10]Lundgreen K，Lian ?，Scott A，et al.Increased levels of apoptosis and p53 in partial-thickness supraspinatus tendon tears[J].Knee Surgery，Sports Traumatology，Arthroscopy，2013，21（7）：1636-1641.

[11] Dalby K N，Tekedereli I，Lopez-Berestein G，et al.Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer[J].Autophagy，2010，6（3）：322-329.

[12] Vergne I，Deretic V.The role of PI3P phosphatases in the regulation of autophagy[J].Febs Lett，2010，584（7）：1313-1318.

[13] Almonte-Becerril M，Navarro-Garcia F，Gonzalez-Robles A，et al.Cell death of chondrocytes is a combination between apoptosis and autophagy during the pathogenesis of osteoarthritis within an experimental model[J].Apoptosis，2010，15（5）：631-638.

（收稿日期：2014-03-17） （本文编辑：欧丽）