蛹虫草新菌株3号多糖提取及其抗氧化作用*

王 多，李宁馨，刘桂宇，董素蓉，柴惠霞**

(1.河北师范大学，河北 石家庄 050024；2.河北女子职业学院，河北 石家庄 050091)

蛹虫草新菌株3号多糖提取及其抗氧化作用*

王 多1，李宁馨1，刘桂宇1，董素蓉2，柴惠霞1**

(1.河北师范大学，河北 石家庄 050024；2.河北女子职业学院，河北 石家庄 050091)

对蛹虫草新菌株3号多糖进行提取纯化，通过体外氧化反应体系评价蛹虫草新菌株3号粗多糖及精多糖总还原力、羟自由基清除能力及不同浓度时蛹虫草新菌株3号粗多糖羟自由基清除能力。结果表明，蛹虫草粗多糖总还原力为0.182，羟自由基清除率为84.4%，且随多糖浓度上升，羟自由基清除率增大。蛹虫草新菌株3号精多糖总还原力为0.136，羟自由基清除率为55.3%。蛹虫草新菌株3号粗多糖总还原力、羟自由基清除率均优于蛹虫草新菌株3号精多糖。由此推断蛹虫草新菌株3号中多糖种类繁杂，并非单一多糖，其中含有多种抗氧化功能的多糖，且多糖之间的抗氧化功能可能存在协同作用。

蛹虫草新菌株3号；多糖提取；抗氧化

蛹虫草新菌株3号(Cordycepsmilitaris)是真菌门(Eumycota)、子囊菌亚门(Ascomycotina)、麦角菌目(Clavicipitales)、麦角菌科(Clavicepitaceae)、虫草属(Cordyceps)的模式种，俗名又称虫草花、北蛹虫草新菌株3号、北冬虫夏草等，是1种珍贵的食药兼用的真菌[1，2]。蛹虫草的有效成分和药效与天然冬虫夏草高度相似，在药化、药理和临床实验中被证明可作为冬虫夏草的重要人工替代品[3，4]。近年来，随着蛹虫草新菌株3号药用保健等功能的不断应用和人工繁殖技术日趋成熟，市场上存在大量人工培育的蛹虫草新菌株3号，但质量差距较大[5]。不同蛹虫草新菌株3号菌株的虫草多糖含量不同，并且同一菌株因为培养基等因素的差异，也会导致多糖含量的变化[6]。虫草多糖是蛹虫草新菌株3号中含量最高的药理活性物质，具有良好的抗盐性、增稠性、触变性、耐热性等[7，8]，可调节人体免疫功能，且在抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖、抑菌、改善肝功能等方面均有显著功效[9-15]。

本研究以石家庄创新食用菌研究所提供的蛹虫草新菌株3号菌丝为实验材料，分析了菌丝多糖含量、羟自由基清除率、总还原力以及粗多糖不同浓度时对羟自由基清除率，进一步筛选多糖产量高、抗氧化活性好的蛹虫草新菌株3号提供依据，为蛹虫草新菌株3号保健品在医药等领域的应用奠定基础。

1 材料与试剂

1.1 样品来源

以小麦为培养基的蛹虫草新菌株3号菌丝(石家庄创新菌类研究所提供)，将样品干燥后研磨成粉末待测。

1.2 仪器与试剂

uv-5分光光度计、立式摇床等。浓硫酸、重蒸苯酚、葡萄糖等。

2 实验方法

2.1 蛹虫草新菌株3号多糖的提取、分离和纯化

2.1.1 提取工艺

以烘干的蛹虫草新菌株3号菌丝为实验组，以烘干的小麦培养基为对照组，分别粉碎后用无水乙醇提取6 h以除去单糖和脂溶性成分，烘干。残渣于70℃条件下用水提取3次，过滤，滤液减压浓缩，加入无水乙醇至体积分数为80%，离心，得沉淀。沉淀溶于水，Savage法除去蛋白质，再用50%乙醇沉淀，冷冻干燥后获得蛹虫草新菌株3号菌丝粗多糖和对照组多糖[16]。

2.1.2 凝胶过滤法分离纯化

Sephadex G-75置直径为3 cm的层析柱，0.1 mol·L-1的NaCl溶液平衡。洗脱液流速0.5 mL·min-1，将实验组样品溶解于1 mL水中，过柱；部分收集器收集洗脱液50管，每管3 mL；定量取各管收集液0.2 mL，苯酚硫酸法测含量，分光光度计490 nm处测OD值。

2.2 多糖含量测定

2.2.1 标准曲线绘制

称取干燥至恒重的葡萄糖50 mg，置于 1 000 mL 量瓶中，配成50 μg·mL-1浓度的葡萄糖溶液。取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于试管中，加水至2 mL。加入0.5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入硫酸5 mL，摇匀后放置10 min。置25℃水浴中15 min，取出冷却至室温，于波长490 nm处测定吸收值，绘制标准曲线，计算葡萄糖含量C与吸光值A的回归方程：A= 4.3085C+ 0.2307，R2=0.9992。

2.2.2 待测品测定

精密量取供试液，按 2.2.1 方法操作，并按标准曲线计算多糖含量。

2.3 抗氧化分析

2.3.1 总还原力测定

具塞试管中加样品、磷酸钠缓冲溶液及1%K3[Fe(CN)6]，置于50℃恒温水浴中反应20 min，再加入10%C2HCl3O2溶液，取反应液1.5 mL，加3.0 mL水和0.2 mL1% FeCl3溶液，混合均匀，5 min后于波长700 nm处测定其吸光值[17]。

2.3.2 羟自由基清除能力测定

利用 Fenton反应测定虫草多糖对亚铁离子催化过氧化氢产生的羟自由基清除能力[18]。反应体系含有H2O21 mL、FeSO41 mL、水杨酸-乙醇1 mL、3种多糖溶液(浓度 30mg·mL-1)1 mL。最后加H2O2启动反应，以蒸馏水作为参比，在波长510 nm处测定各浓度的吸光度值。每个浓度重复3次，取吸光度值的平均值。·OH清除率的计算公式为：

P=[A0-(AX-AX0)]A0×100%

式中：A0为空白对照液吸光度值，只加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、过氧化氢，不加入虫草多糖溶液的吸光度值；AX为加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、过氧化氢、虫草多糖的吸光度值；AX0为加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、虫草多糖溶液，不加过氧化氢引发反应的吸光度值。

2.3.3 不同浓度的蛹虫草新菌株3号粗多糖羟自由基清除率的比较

利用Fenton反应测定蛹虫草多糖对羟自由基的清除能力。将蛹虫草新菌株3号精多糖精确配制为浓度30 mg·mL-1，用蒸馏水将该溶液稀释为6种浓度：5 mg·mL-1、10 mg·mL-1、15 mg·mL-1、20 mg·mL-1、25 mg·mL-1、30 mg·mL-1，其余按2.3.2方法操作于波长510 nm处测吸光度值。

3 结果

3.1 凝胶色谱法洗脱曲线

以NaCl溶液对蛹虫草新菌株3号粗多糖和对照组分别进行洗脱，前者洗脱曲线如图1所示，后者脱曲线如图2所示。

图1、图2对比得知，蛹虫草新菌株3号粗多糖吸光度峰值较对照组高数倍，且前者多糖集中于10管～14管，后者多糖集中于9管～14管。收集蛹虫草新菌株3号粗多糖峰面积最大洗脱峰，脱盐，浓缩后分别得到蛹虫草新菌株3号小麦精多糖。

3.2 多糖含量测定

蛹虫草新菌株3号菌丝多糖、对照组多糖含量情况见表1。

表1 蛹虫草新菌株3号菌丝和对照组多糖含量

注：表中数据为均值±SD；同行数据后不同小写字母分别表示差异显著(p<0.05，t-test)。

由表1可见，蛹虫草新菌株3号菌丝中多糖含量大于对照组中多糖含量。

3.3 抗氧化试验

对蛹虫草新菌株3号粗多糖、蛹虫草精多糖和对照组多糖分别进行总还原力和羟自由基清除率的测定，结果如图3、图4所示。

图3、图4结果表明，三者的总还原力依次为蛹虫草新菌株3号粗多糖>蛹虫草新菌株3号精多糖>对照组；三者的羟自由基清除率依次为蛹虫草新菌株3号粗多糖>蛹虫草新菌株3号精多糖>对照组。

3.4 不同浓度时蛹虫草新菌株3号粗多糖羟自由基清除率比较

蛹虫草新菌株3号粗多糖对羟自由基有良好的清除效果，其结果见图5。

本实验体系中，羟自由基清除效果与多糖质量浓度相关性很高，当蛹虫草新菌株3号粗多糖质量浓度上升到30 mg·mL-1时，清除率达到84.4%。

4 讨论

本研究结果表明，蛹虫草新菌株3号菌丝中多糖的洗脱峰值明显高于对照组多糖，两者洗脱时间不同表明两者多糖的结构不同。蛹虫草新菌株3号菌丝中多糖含量大于对照组多糖含量。蛹虫草新菌株3号粗多糖的总还原力及羟自由基清除率均优于蛹虫草新菌株3号精多糖，这表明蛹虫草新菌株3号中多糖种类繁杂，并非单一多糖，其中含有多种具有抗氧化功能的多糖，且多糖之间的抗氧化功能可能存在协同作用，故对其进行纯化并不利于其更好地发挥抗氧化功能。

蛹虫草新菌株3号粗多糖羟自由基清除率最高可达84.4%。孟兆丽等[18]报道的蛹虫草子实体提取蛹虫草多糖CM-40、CM-60及CM-80羟自由基清除率分别为60.8%、71.1%和85.7%；曲瑾郁等[19]报道的蛹虫草新菌株3号子实体提取虫草多糖羟自由基清除率为81.14%，硫酸化修饰后的蛹虫草多糖羟自由基清除率78.66%，乙酰化修饰后的虫草多糖羟自由基清除率84.26%，羧甲基化修饰后的虫草多糖羟自由基清除率为57.9%；张杰等[20]报道蛹虫草新菌株3号子实体提取的虫草胞内多糖羟自由基清除率最高可达100%。同以上报道相比，本实验所用蛹虫草新菌株3号所获得的蛹虫草多糖的抗氧化性较强，蛹虫草3号粗多糖总还原力为0.182。曲瑾郁[19]等报道蛹虫草新菌株3号子实体提取的蛹虫草多糖总还原力为0.049，硫酸化修饰后的蛹虫草多糖总还原力为0.054，乙酰化修饰后的蛹虫草多糖总还原力为0.069，羧甲基化修饰后的蛹虫草多糖总还原力为0.088，同以上报道相比，本实验使用蛹虫草新菌株3号所获得的蛹虫草多糖还原力最强，同时本研究结果还为该蛹虫草新菌株3号菌株在医疗保健领域的应用奠定了理论基础。

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The Extraction and Anti-oxidation Activity of Polysaccharide from a New Strain ofCordycepsmilitaris

WANG Duo1, LI Ning-xin1, LIU Gui-yu1, DONG Su-rong2, CHAI Hui-xia1

(1.Hebei Normal University, ShijiazhuangHebei050024; 2.Hebei Women’s Vocational College, ShijiazhuangHebei050091)

The polysaccharide preparations were obtained from culturedCordycepsmilitarisnew strain(No.3). The total reducing power and hydroxy radical scavenging capacity of the crude polysaccharides and the refined polysaccharides fromCordycepsmilitarisnew strain(No.3) were determined and compared. The hydroxy radical scavenging capacity of crude polysaccharides fromCordycepsmilitarisnew strain(No.3) at different doses were also determined. The results showed that the total reducing power of crude polysaccharides fromCordycepsmilitarisnew strain(No.3) was 0.182 and hydroxy radical scavenging capacity was 84.4%. The hydroxy radical scavenging capacity increased with the increasing concentration of crude polysaccharides. The total reducing power of refined polysaccharide fromCordycepsmilitarisnew strain(No.3) was 0.136 and hydroxy radical scavenging capacity was 55.3%. The total reducing power and hydroxy radical scavenging capacity of the crude polysaccharides were stronger than the refined polysaccharides. The results above indicated that several polysaccharides with antioxidant function existed in the new strain ofCordycepsmilitarisnew strain(No.3) and these polysaccharides acted synergistically.

New strain ofCordycepsmilitaris(No.3); Polysaccharide extraction; Antioxidant property

*项目来源：河北省自然科学基金“蛹虫草多糖对小鼠盆腔炎抑菌效果的研究”(C2011205111)。

王多(1980-)，女，实验师，主要从事生态学相关研究。

**通信作者：柴惠霞(1958-)，女，副主任医师，主要从事妇科学方向研究。E-mail: chxwjb@163.com

2014-09-25

S646.9

A

1003-8310(2014)06-0056-03